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實時熒光定量PCR的定量原理
閱讀：536 發(fā)布時間：2023-5-15
實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標(biāo)序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。
實時熒光定量PCR是利用熒光信號的變化，實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。
1．?dāng)U增曲線
在實時熒光定量PCR進程中，通過熒光定量PCR儀，在PCR每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集，以熒光強度為縱軸，循環(huán)次數(shù)為橫軸，所得到的曲線稱為PCR的擴增曲線。
2．熒光閾值
實時熒光定量PCR的前面十多個循環(huán)，熒光強度變化不大，熒光強度的平均值可稱為基線值，在基線值的基礎(chǔ)上，增加一定數(shù)量后得到一熒光值，這一點后，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強度明顯增強，因此稱該值為熒光閾值。一般取PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。
3．Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線
Ct值是指PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn)，Ct值與反應(yīng)管內(nèi)的模板數(shù)密切相關(guān)，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。