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一步法 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）

MCE 國際站：One Step TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件： -20℃ 保存一年避光保存

簡介：MCE 一步法 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒采用一步染色的方法快速檢測細(xì)胞凋亡。染色后，正常細(xì)胞基本無熒光，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光。

概述：MCE一步法 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒采用一步染色的方法快速檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡時,相關(guān)DNA 內(nèi)切酶被激活,進(jìn)而切斷核小體間的基因組DNA,產(chǎn)生 180-200 bp 的 DNA ladder,其暴露的3'-OH 經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)催化后可加上綠色熒光探針 FITC 標(biāo)記的 dUTP,借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀即可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。FITC最大激發(fā)波長為488 nm,最大發(fā)射波長為525 nm,凋亡細(xì)胞顯示綠色熒光,正常細(xì)胞無熒光。

描述：

MCE一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒（FITC）為檢測細(xì)胞凋亡提供了一種快速、方便的方法。細(xì)胞凋亡時，特異性的DNA內(nèi)切酶會被激活，將基因組DNA在核小體之間切割。凋亡細(xì)胞的DNA被切割成180-200bp片段的多聚體。斷裂的DNA暴露的3'-OH可在熒光素標(biāo)記的dUTP的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化下發(fā)生反應(yīng)，可用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。FITC的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488nm和525nm。

操作說明：樣品準(zhǔn)備1.1貼壁細(xì)胞:a.洗滌:棄去培養(yǎng)基,加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。b.固定:加入固定液4℃固定30分鐘。c.洗滌:加入 PBS 洗滌 2次,每次5分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。e.洗滌:加入 PBS 洗滌 2 次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。1.2懸浮細(xì)胞:a.洗滌:離心收集細(xì)胞(不超過2X106個細(xì)胞),加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。b.固定:加入固定液4℃固定30分鐘。注:建議置于搖床上固定,以防止細(xì)胞聚團(tuán)。c.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。e.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。1.3 石蠟切片:a.脫蠟:室溫下將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟5-10分鐘,重復(fù)兩次。b.水化:用無水乙醇浸泡5分鐘,重復(fù)兩次。隨后用梯度乙醇(90%、80%、70%)依次浸泡2分鐘。c.洗滌:加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入適量蛋白酶K溶液,室溫孵育 15-30分鐘。注:需自行優(yōu)化蛋白酶K溶液孵育的溫度和時間。e.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘,除盡蛋白酶K,并用濾紙吸去多余的液體。1.4 冰凍切片a.固定:將冰凍切片回溫至室溫。加入固定液4℃ 固定30-60分鐘。b.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次10分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。C.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。d.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次10分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。注:所有處理好的樣本建議置于濕盒中保持濕潤,切勿讓樣品干燥。配制 TUNEL 工作液注：配制好的 TUNEL 工作液禁止冷凍保存。標(biāo)記與檢測對于貼壁細(xì)胞或組織切片:加入50μL TUNEL工作液,37℃避光孵育60分鐘。加入PBS 洗滌3次。加入抗熒光淬滅封片液(HY-K1042)封片后在熒光顯微鏡下觀察熒光效果。注:a.注意避免 TUNEL 工作液的蒸發(fā)。b.對于6孔板的每個孔,宜加入100μL TUNEL 工作液。c.若 TUNEL 反應(yīng)過強(qiáng),可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme稀釋2-5 倍后再進(jìn)行操作。對于懸浮細(xì)胞:加入50μL TUNEL工作液,37C避光孵育60 分鐘。加入PBS 洗滌3次。加入250-500 μL PBS 充分懸浮細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察熒光效果。注:若 TUNEL 反應(yīng)過強(qiáng),可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme 稀釋2-5 倍后再進(jìn)行操作

注意事項：1.樣品通透前可用石蠟筆在樣品周圍描繪樣品輪廓,以便于后續(xù)通透處理。2.所有處理好的樣本建議置于濕盒中保持濕潤,切勿讓樣品干燥。3.固定懸浮細(xì)胞時,為防止細(xì)胞聚集成團(tuán),建議置于搖床中進(jìn)行固定。4.配制 TUNEL 工作液時需充分混勻,現(xiàn)用現(xiàn)配,注意避光,禁止冷凍保存。5.熒光染料都存在淬滅的問題,染色后應(yīng)盡快檢測熒光強(qiáng)度,且整個實驗過程盡量避光下進(jìn)行。6.若 TUNEL 反應(yīng)過強(qiáng),可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme 稀釋 2-5倍后再進(jìn)行操作。7.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。8.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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