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Anti-HA 親和凝膠

MCE 國(guó)際站：Anti-HA Affinity Gel

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件：4℃，2 年禁止凍結(jié)

簡(jiǎn)介：MCE Anti-HA 親和凝膠可用于檢測(cè)和純化 HA 融合表達(dá)蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白在靶細(xì)胞中的表達(dá)。

概述：HA 標(biāo)簽是人流感血凝素的 98-106 氨基酸序列 YPYDVPDYA。MCE Anti-HA 親和凝膠由高品質(zhì)的 HA 抗體與瓊脂糖共價(jià)偶聯(lián)制成，具有高載量、高特異性和性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，Anti-HA 親和凝膠可以識(shí)別 C 端，N 端 HA 標(biāo)簽蛋白融合蛋白，可用于檢測(cè)和純化 HA 融合表達(dá)蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白在靶細(xì)胞中的表達(dá)。本產(chǎn)品每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取。

描述：

MCE 抗 HA 親和凝膠是由高品質(zhì) HA 抗體與瓊脂糖共價(jià)偶聯(lián)而成，具有載量高、特異性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)?？?HA 親和凝膠可識(shí)別 C 和 N 端 HA 標(biāo)記的融合蛋白，適合檢測(cè)和純化 HA 融合表達(dá)蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)靶細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)。

本產(chǎn)品每 1 mL 總體積含有 0.5 mL 凝膠。使用前，請(qǐng)確保凝膠在抽吸前已懸浮并混合。

操作說(shuō)明：蛋白純化樣品在上樣前建議離心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率。1. 中壓層析柱法1) 裝柱：將 Anti-HA 親和凝膠裝入合適的層析柱中，連接層析柱與色譜系統(tǒng)。2) 柱平衡：用 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液清洗進(jìn)行柱平衡。重復(fù) 2-3 次。3) 上樣：利用泵或樣品環(huán)上樣，收集流出液，可以反復(fù)上樣提高結(jié)合效率。注：a. 請(qǐng)根據(jù)蛋白量選擇合適凝膠量，上樣量避免超過(guò)柱子的結(jié)合能力； b. 樣品粘度或體積增加可能會(huì)造成層析柱反壓。4) 洗雜：使用 10-50 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液，直至紫外吸收基線趨于平衡。5) 洗脫提供兩種洗脫方案，可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。a. 酸性洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液 Ⅰ 進(jìn)行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：酸性洗脫后填料要立即用結(jié)合緩沖液平衡，Anti-HA 親和凝膠在洗脫液中不要超過(guò) 20 min。b. 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：使用 3-5 倍體積的洗脫緩沖液 Ⅱ 進(jìn)行洗脫，分管收集，收集的洗脫液即為目的蛋白。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5 倍柱體積洗脫緩沖液 Ⅰ 或洗脫緩沖液 Ⅱ 洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。7) 保存：使用 5-10 倍柱體積凝膠儲(chǔ)存緩沖液平衡層析柱，卸下層析柱，置于 2-8℃保存。2. 重力柱法1) 裝柱：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-HA 親和凝膠混懸液加入重力層析柱中，去除保護(hù)液。2) 柱平衡：使用 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液對(duì)已裝填好的重力層析柱進(jìn)行柱平衡。重復(fù) 2-3 次。3) 上樣：樣品加入后至少保留 2 min，以保證樣品與介質(zhì)充分接觸，收集流出液。注：反復(fù)上樣可提高結(jié)合效率。4) 洗雜：使用 10-15 倍柱體積的洗滌緩沖液進(jìn)行洗雜，以去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液。5) 洗脫提供兩種洗脫方案，可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。a. 酸性洗脫：酸性洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液 Ⅰ 進(jìn)行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：酸性洗脫后填料要立即用結(jié)合緩沖液平衡，Anti-HA 親和凝膠在洗脫液中不要超過(guò) 20 min。b. 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：使用 3-5 倍體積的洗脫緩沖液 Ⅱ 進(jìn)行洗脫，分管收集，收集的洗脫液即為目的蛋白。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5-10 倍柱體積洗脫緩沖液 Ⅰ 或 洗脫緩沖液 Ⅱ 洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。7) 保存：使用 5 倍柱體積凝膠儲(chǔ)存緩沖液平衡層析柱，置于 2-8℃保存。3. 離心法1) 填料預(yù)處理：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-HA 親和凝膠混懸液加入離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。加入 5 倍凝膠體積的結(jié)合緩沖液清洗，5,000 g 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 2-3 次。2) 結(jié)合：加入樣品，封閉離心管，4°C 孵育 2-4 h (或 37°C 孵育 0.5-2 h)。3) 洗滌：孵育完成后，5,000 g 離心 1 min，棄上清 (上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)。使用 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，5,000 g 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 3-5 次。4) 洗脫提供兩種洗脫方案，可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。a. 酸性洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液 Ⅰ 進(jìn)行洗脫，室溫孵育 5-10 min，5,000 g 離心 1 min，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析?？芍貜?fù) 2-3 次并分別收集上清液。注：酸性洗脫后填料要立即用結(jié)合緩沖液平衡，Anti-c-Myc 親和凝膠在洗脫液中不要超過(guò) 20 min。b. 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：使用 3-5 倍凝膠體積的洗脫緩沖液 Ⅱ 進(jìn)行洗脫，室溫孵育 5-10 min，5,000 g 離心 1 min，收集的上清液即為目的蛋白?？芍貜?fù) 2-3 次并分別收集上清液。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。5) 再生及保存：使用 5-10 倍凝膠體積的洗滌緩沖液沖洗介質(zhì)，再用 5-10 倍凝膠體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍凝膠體積的凝膠儲(chǔ)存緩沖液沖洗，置于 2-8°C 保存。免疫共沉淀 IP1. 凝膠預(yù)處理1) 將 Anti-HA 親和凝膠重懸混勻，吸取 40 μL 凝膠懸液（約 20 μL 凝膠）至干凈的 1.5 mL 離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。2) 加入 500 μL 結(jié)合緩沖液，混合均勻，5,000 g 離心 1 min，棄上清。重復(fù) 2-3 次。2. 樣品結(jié)合1) 在上述清洗干凈的凝膠中加入 200-1,000 μL 樣品。充分混勻后，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育，4℃ 孵育 2 h。如需提高結(jié)合效率，可過(guò)夜孵育。注：對(duì)于易降解的蛋白，建議添加蛋白酶抑制劑。2) 5,000 g離心 1 min，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管 (上清液可用于檢測(cè) HA 標(biāo)簽蛋白是否有殘留)。3. 洗滌在上述分離得到的凝膠中加入 500 μL 洗滌緩沖液，充分混懸凝膠，5,000 g m 離心 1 min，棄去上清。重復(fù)以上洗滌步驟 3 次以上，直到洗滌后的上清液中 OD280 小于 0.05 為止。注：多次洗滌的目的是確保去除非特異性吸附，如上清液的 OD280 大于 0.05，可增加洗滌次數(shù)。4. 洗脫提供三種洗脫方案，可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。1) 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50-100 μL 洗脫緩沖液 Ⅰ，充分混勻后室溫孵育 5 min，5,000 g離心 1 min，收集上清并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。2) 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50-100 μL 洗脫緩沖液 Ⅱ，室溫孵育 30 min，5,000 g離心 1 min，收集上清。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。3) 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測(cè)。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 20-50 μL 2× SDS-PAGE Loading Buffer，充分混勻后 95℃ 加熱 5 min。5000 g離心 1 min，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。注：由于常規(guī) SDS-PAGE Loading Buffer 中含有 β-疏基乙醇和 DTT會(huì)使填料中抗體輕重鏈斷開，同時(shí)含有 SDS 的 Loading Buffer 可以使介質(zhì)配體變性，因此變性洗脫后的 Anti-HA 親和凝膠不能重復(fù)使用。

注意事項(xiàng)：1. 本產(chǎn)品使用前務(wù)必充分重懸凝膠。2. 使用本產(chǎn)品進(jìn)行 IP 實(shí)驗(yàn)前，需先確認(rèn)樣品中 HA 標(biāo)簽蛋白的表達(dá)情況。3. 為最大限度的降低蛋白質(zhì)降解，請(qǐng)配合使用 MCE 蛋白酶抑制劑 cocktails (MCE 貨號(hào) HY-K0010，HY-K0011)。4. 不要使用含有 DTT 的細(xì)胞裂解液樣品，DTT 可能會(huì)引起凝膠上的 HA 抗體脫落5. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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