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蛋白 A/G 瓊脂糖

MCE 國(guó)際站：Protein A/G Agarose

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件：4℃，2 年禁止凍結(jié)

簡(jiǎn)介：MCE 蛋白 A/G 瓊脂糖是用于分離、純化抗體的通用型親和層析介質(zhì)。

概述：MCE 蛋白 A/G 瓊脂糖是用于分離、純化抗體的通用型親和層析介質(zhì)。以高度交聯(lián)的 4% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過(guò)化學(xué)方法定向、高密度定向偶聯(lián)了重組 Protein A、Protein G 蛋白，可結(jié)合血清、腹水、培養(yǎng)上清液和其他抗體樣品中幾乎所有同種型和哺乳動(dòng)物物種的 IgG，從而實(shí)現(xiàn)高效抗體純化。本產(chǎn)品每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取MCE 蛋白 A/G 瓊脂糖的特點(diǎn)：? 蛋白 A/G：蛋白 A 和 G 的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的固定化充足融合蛋白可對(duì)幾乎任何哺乳動(dòng)物物種進(jìn)行多克隆 IgG 純化? 惰性且穩(wěn)定：通過(guò)不帶電荷的共價(jià)鍵固定蛋白 A/G，因此非特異性結(jié)合較低且能夠多次使用而不降低得率

描述：

MCE Protein A/G 瓊脂糖是一種用于分離和純化免疫球蛋白的親和層析介質(zhì)。

MCE Protein A/G 瓊脂糖由純化的 Protein A/G 重組融合蛋白組成，該融合蛋白共價(jià)固定在高質(zhì)量交聯(lián) 4% 珠狀瓊脂糖上，可結(jié)合血清、腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他抗原中的幾乎所有同種型和哺乳動(dòng)物種類(lèi)的 IgG。

該產(chǎn)品每 1 mL 總體積含有 0.5 mL 凝膠。使用前，請(qǐng)確保在抽吸前將凝膠懸浮并混合。

操作說(shuō)明：蛋白純化建議在純化前使用 0.22 μm 或 0.45 μm 過(guò)濾器對(duì)樣品進(jìn)行樣品過(guò)濾處理。1. 中壓層析柱法1) 裝柱：將蛋白 A/G 瓊脂糖裝入合適的層析柱中，連接層析柱與色譜系統(tǒng)。2) 柱平衡：用 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液清洗進(jìn)行柱平衡。重復(fù) 2-3 次。3) 上樣：利用泵或樣品環(huán)上樣，收集流出液，可以反復(fù)上樣提高結(jié)合效率。注：a. 請(qǐng)根據(jù)蛋白量選擇合適凝膠量，上樣量避免超過(guò)柱子的結(jié)合能力； b. 樣品粘度或體積增加可能會(huì)造成層析柱反壓。4) 洗雜：使用 10-20 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液，直至紫外吸收基線趨于平衡。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗滌緩沖液進(jìn)行洗脫，收集管立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），分管收集，收集的洗脫液即為目的蛋白。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5-10 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫層析柱，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。注：酸性洗脫后瓊脂糖凝膠要立即用洗滌緩沖液平衡，凝膠在洗脫液中不要超過(guò) 20 min。7) 儲(chǔ)存：使用 5-10 倍柱體積凝膠儲(chǔ)存緩沖液平衡層析柱，卸下層析柱，置于 2-8℃保存。2. 重力柱法1) 裝柱：依照所需純化的樣品量，取適量 Protein A/G Agarose 混懸液加入重力層析柱中，去除保護(hù)液。2) 柱平衡：使用 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液對(duì)已裝填好的重力層析柱進(jìn)行柱平衡。重復(fù) 2-3 次。3) 上樣：樣品加入后至少保留 2 min，以保證樣品與介質(zhì)充分接觸，收集流出液。注：反復(fù)上樣可提高結(jié)合效率。4) 洗雜：使用 10-15 倍柱體積的洗滌緩沖液進(jìn)行洗雜，以去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集管中預(yù)先加好中和緩沖液，加入量為 100 μL/mL 洗脫緩沖液，收集的洗脫液即為目的蛋白。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5-10 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗層析柱。7) 保存：使用 5-10 倍柱體積凝膠儲(chǔ)存緩沖液平衡層析柱，置于 2-8℃保存。3. 離心法1) 填料預(yù)處理：依照所需純化的樣品量，取適量 Protein A/G Agarose 混懸液加入離心管中，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清。加入 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 2-3 次。2) 結(jié)合：加入樣品，封閉離心管，4°C 孵育 2-4 h (或 37°C 孵育 0.5-2 h)。3) 洗滌：孵育完成后，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清 (上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)。使用 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 3-5 次。4) 洗脫：使用 3-5 倍凝膠體積的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，室溫孵育 5 min，1,000 rpm 離心 1 min，收集的上清液即為目的蛋白?？芍貜?fù) 2-3 次并分別收集上清液。注：最終收集的洗脫液為酸性，需立即加入中和緩沖液將洗脫產(chǎn)物 pH 調(diào)至中性，加入量為 100 μL/mL 洗脫緩沖液，樣品用于后期功能分析。5) 再生及保存：使用 5-10 倍凝膠體積的洗滌緩沖液沖洗介質(zhì)，再用 5-10 倍凝膠體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍凝膠體積的凝膠儲(chǔ)存緩沖液沖洗，置于 2-8°C 保存。免疫共沉淀1. 凝膠預(yù)處理1) 將 Protein A/G Agarose 重懸混勻，吸取適量凝膠懸液至干凈的 2 mL 離心管中，800 rpm 離心 1 min，棄上清。2) 加入 500 μL 結(jié)合緩沖液，混合均勻，800 rpm 離心 1 min，棄上清。重復(fù) 3-4 次。2. 抗體結(jié)合1) 加入適量稀釋后的抗體溶液充分重懸凝膠，置于翻轉(zhuǎn)混勻儀室溫孵育 30 min 或 4℃ 2 h，800 rpm 離心 1 min，收集上清液，留待檢測(cè)。2) 加入 500 μL 洗滌緩沖液充分重懸凝膠，置于翻轉(zhuǎn)混勻儀室溫孵育 3-5 min，去除非特異性吸附的雜蛋白，800 rpm 離心 1 min，棄上清。重復(fù) 2-3 次。3. 抗原免疫沉淀反應(yīng)1) 抗原結(jié)合：加入含抗原的樣品充分重懸凝膠，置于翻轉(zhuǎn)混勻儀室溫孵育 10-30 min，使抗原與抗體充分結(jié)合，也可 4℃ 孵育過(guò)夜。注：a. 若抗原抗體結(jié)合較弱可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間；b. 建議添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白降解。2) 800 rpm 離心 1 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中（上清液可用于后續(xù)檢測(cè)）。4. 洗滌1) 在上述分離得到的凝膠中加入 1 mL 洗滌緩沖液，充分重懸凝膠，800 rpm 離心 1 min，棄去上清。重復(fù)以上洗滌步驟 2-3 次，直到洗滌后的上清液中 OD280 小于 0.05 為止。注：多次洗滌的目的是確保去除非特異性吸附，如上清液的 OD280 大于 0.05，可增加洗滌次數(shù)。2) 加入1 mL 洗滌緩沖液，充分重懸凝膠轉(zhuǎn)移至新的離心管中，800 rpm 離心 1 min，棄去上清。5. 洗脫本說(shuō)明書(shū)提供兩種洗脫方案，可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。1) 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 100-200 μL 洗脫緩沖液，置于翻轉(zhuǎn)混勻儀室溫孵育 10 min，800 rpm 離心 1 min，收集上清至新的離心管中，即為目標(biāo)抗原。按照每 1 mL 洗脫緩沖液加入 100 μL 中和緩沖液將洗脫產(chǎn)物 pH 調(diào)節(jié)至中性 (pH 7.0-8.0)，樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長(zhǎng)期存放建議置于 -20℃ 中。2) 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測(cè)。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 20-50 μL 2× SDS-PAGE Loading Buffer，充分混勻后 95℃ 加熱 5 min。800 rpm 離心 1 min，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。注：由于常規(guī) SDS-PAGE Loading Buffer 可以使介質(zhì)配體變性，因此變性洗脫后的 Protein A/G Agarose 不能重復(fù)使用。

注意事項(xiàng)：1. 本產(chǎn)品使用前務(wù)必充分重懸凝膠。2. 為最大限度的降低蛋白質(zhì)降解，請(qǐng)配合使用 MCE 蛋白酶抑制劑 cocktails (MCE 貨號(hào)HY-K0010，HY-K0011)。3. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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