MCE 國際站:Ni-NTA 6FF Prepacked Column
品牌:MedChemExpress (MCE)
存儲條件:4°C 兩年
簡介:MCE Ni-NTA 6FF Prepacked Column 為具有標(biāo)準(zhǔn)接口的預(yù)裝柱產(chǎn)品,適用于各類中低壓色譜系統(tǒng),方便客戶純化細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲及桿狀病毒等表達(dá)的 His 標(biāo)簽重組蛋白。
概述:MCE Ni-NTA 6FF Prepacked Column 是一種以 6% Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 為填料的預(yù)裝柱,通過化學(xué)方法偶聯(lián)了四配位的氮川三乙酸 (NTA) 為配體,螯合鎳離子 (Ni2+) 后,可以形成非常穩(wěn)定的八面體結(jié)構(gòu),Ni2+ 處于中心,可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等。本產(chǎn)品具有標(biāo)準(zhǔn)接口,可用于各類商品化的中低壓色譜系統(tǒng),如 AKTA 等,方便客戶純化細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲及桿狀病毒等表達(dá)的 His 標(biāo)簽重組蛋白。
描述:
Ni-NTA His-Tag 純化瓊脂糖是一種 6% 高度交聯(lián)的瓊脂糖介質(zhì),共價偶聯(lián)到螯合劑上,該螯合劑通過四個配位點(diǎn)與 Ni2+ 結(jié)合,可實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高純度的多組氨酸標(biāo)記蛋白純化。Ni-NTA His-Tag 純化瓊脂糖具有低 Ni2+ 泄漏、高蛋白結(jié)合能力和穩(wěn)定性,并且與多種化學(xué)品和 pH 值兼容。這使得 Ni-NTA 6FF 預(yù)裝柱成為高效純化大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多組氨酸標(biāo)記蛋白的理想選擇。
特性 | |
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成分 | 6% 高交聯(lián)瓊脂糖 |
珠子直徑 | 45-165 μm |
結(jié)合容量 | >>40 mg 6× His 標(biāo)記蛋白/mL 沉降樹脂 |
應(yīng)用 | 0.3 MPa, 3 bar |
建議劑量 | 20% 乙醇溶液中的 50% 漿液 |
操作說明:1. Buffer 的準(zhǔn)備:請根據(jù)不同的樣品選擇合適的 Buffer,也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣配置不同的緩沖液體系,基本原則是“低咪唑上樣,高咪唑洗脫",或者“高 pH 上樣,低 pH 洗脫"。Buffer 在使用前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 濾膜過濾除菌。Ni-NTA 6FF Prepacked Column 可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化,兩者所需 Buffer 不同。2. 樣品處理細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白(1) 挑取單菌落到含有適合抗性的培養(yǎng)基,根據(jù)載體使用說明加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時間。(2) 表達(dá)結(jié)束后,收集菌液至離心管中,7000 rpm,離心 15 分鐘,棄上清,收集菌體沉淀。按照菌體: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例將菌體重懸混勻,加入PMSF (終濃度為 1 mM),加入溶菌酶 (工作濃度為 0.2-0.4 mg/mL;如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含 pLysS 或 pLysE,可以不加溶菌酶)。也可加入蛋白酶抑制劑,但需確認(rèn)加入的蛋白酶抑制劑不會影響目的蛋白與 Agarose 的結(jié)合。(3) 將菌體沉淀重懸混勻 (如果菌液濃度高,也可選擇加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I),放置在冰上,然后冰上超聲破碎細(xì)胞,至菌液基本保持澄清。(4) 將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,10000 rpm,4oC 離心 20-30 分鐘。取上清,置于冰上備用或 -20oC 保存。酵母、昆蟲和哺乳動物分泌表達(dá)可溶性蛋白(1) 將細(xì)胞培養(yǎng)液收集至離心管中,5000 rpm,離心 10 分鐘,取上清,棄沉淀。如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì),可直接加入柱子進(jìn)行后續(xù)操作;如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì),需用 Lysis Buffer 在 4oC 條件下透析后才能加入柱子。(2) 對于大量體積的上清,需加入硫酸銨沉淀濃縮后,用 Lysis Buffer 在 4oC 條件下透析后才能加入柱子。包涵體蛋白 (變性條件)(1) 將培養(yǎng)液收集至離心管中,7000 rpm,離心 15 分鐘,棄上清,收集菌體沉淀。(2) 按照菌體: Lysis Buffer (不含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例將菌體重懸混勻,冰浴超聲破碎。(3) 將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,10000 rpm,4oC 離心 20-30 分鐘。棄上清,重復(fù)步驟 (2) 和步驟 (3) 一次。(4) 按照菌體: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例將包涵體懸浮起來。(5) 變性條件下進(jìn)行 His 標(biāo)簽重組蛋白純化操作。3. 樣品純化 (以 AKTA 為例)Ni-NTA 6FF 是一款用于 His 標(biāo)簽蛋白純化的預(yù)裝柱產(chǎn)品,可用于各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。(1) 將泵管道中注滿去離子水。取掉上塞子,將預(yù)裝柱連接至色譜系統(tǒng),再折斷下口,將預(yù)裝柱連接至色譜系統(tǒng)中,并旋緊。(2) 使用 3-5 倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。(3) 平衡:使用至少 5 倍柱體積的 Lysis Buffer 平衡層析柱。(4) 上樣:利用泵或注射器上樣。為了避免堵塞層析柱,樣品應(yīng)經(jīng)離心或使用濾膜 (0.22 μm 或 0.45 μm) 過濾。(5) 洗雜:用 Wash Buffer 沖洗柱子,直到紫外吸收達(dá)到一個穩(wěn)定的基線 (一般至少 10-15 倍柱體積),收集流出組分和洗雜部分。注:在平衡緩沖液加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。(6) 洗脫:用 Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中,通常使用 5 倍柱體積洗脫液;線性梯度洗脫可以用一個小的梯度,例如 20 倍柱體積或更多,來分離不同結(jié)合強(qiáng)度的蛋白質(zhì)。(7) 依次使用 3 倍柱體積的 Lysis Buffer 和 5 倍柱體積的去離子水平衡填料,再用 5 倍柱體積的 20% 乙醇平衡,最后在 20% 乙醇中 4oC 保存。(8) SDS-PAGE 檢測:將純化得到的樣品 (包括流出組分、洗雜部分和洗脫部分)以及原始樣品使用 SDS-PAGE 檢測純化效果。4. 在位清洗 (Cleaning-in Place, CIP)(1) 去除強(qiáng)疏水結(jié)合的蛋白、脂蛋白和脂類:使用 5-10 倍柱體積的 30% 異丙醇清洗,接觸時間為 15-20 分鐘,然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用 2 倍柱體積含有去污劑的酸性或堿性溶液清洗,接觸時間為 1-2 小時,然后使用 5 倍柱體積的 70% 乙醇清洗,最后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。(2) 去除離子作用結(jié)合的蛋白:使用 1.5 M NaCl 溶液清洗,接觸時間為 10-15 分鐘,然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。5. 填料再生當(dāng)填料使用過程中發(fā)現(xiàn)顏色變淺,或者填料載量明顯變低時,需要對填料進(jìn)行鎳離子剝離和鎳離子重掛,即填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nèi),按照下面操作流程進(jìn)行鎳離子剝離和鎳離子重掛。(1) 加入 2 倍柱體積的 0.2 M 醋酸溶液 (含 6 M GuHCl ) 清洗一次。(2) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(3) 加入 3 倍柱體積的 2% SDS 清洗一次。(4) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(5) 加入 5 倍柱體積的無水乙醇清洗一次。(6) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(7) 加入 5 倍柱體積的 100 mM EDTA (pH 8.0) 清洗一次。(8) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(9) 加入 5 倍柱體積的 100 mM NiSO4 清洗一次。(10) 加入 10 倍柱體積的去離子水清洗一次。(11) 填料再生后,可以立即使用,也可以保存在 20% 的乙醇中,置于 4oC 保存。
注意事項(xiàng):1. 請勿干燥或冷凍本產(chǎn)品,以免引起效價降低,降低純化效率。2. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。3. 為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
熱銷產(chǎn)品:Anifrolumab | Sitagliptin | AVE 0991 | SB 525334 | GSK682753A | OSS_128167 | L-Arginine | L-Glutamine | SKL2001 | DL-Isocitric acid (trisodium salt)
Trending products:Recombinant Proteins | Bioactive Screening Libraries | Natural Products | Dye Reagents | PROTAC | Isotope-Labeled Compounds
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