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His標簽純化凝膠珠

MCE 國際站：Ni-NTA His-Tag Purification Agarose

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件：2-8 oC 2 年

簡介：Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 以高度交聯(lián)的 6% 瓊脂糖凝膠為基質，可實現高產量，高純度的 His 標記蛋白的純化。

概述：MCE Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 是 His 標簽蛋白純化介質，也稱為鎳柱，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等，能夠簡單、快速、高特異性地對 His 標簽蛋白進行純化。MCE Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 以高度交聯(lián)的 6% 瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯(lián)了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合鎳離子 (Ni2+) 后，可以形成非常穩(wěn)定的八面體結構，更加穩(wěn)定、高效。MCE Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 可以用于純化細菌、哺乳動物細胞、昆蟲及桿狀病毒等表達的 His 標簽重組蛋白。本品儲存于 20% 乙醇中，每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取。重組蛋白 His 標簽上的組氨酸殘基能特異性地結合到 Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 中的鎳離子上，其他蛋白無法結合而被洗雜步驟清除。洗滌后，His 標簽重組蛋白可在非變性條件下被洗脫，從而被分離純化。

描述：

MCE Ni-NTA His-Tag 純化瓊脂糖由腈三乙酸 (NTA) 螯合劑活化的瓊脂糖珠組成，隨后通過四個配位位點帶上二價鎳 (Ni²⁺) 離子。

親和層析純化試劑具有低 Ni²⁺ 泄漏、高蛋白質結合能力和穩(wěn)定性，并且與多種化學品和 pH 值兼容，使其成為大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物表達系統(tǒng)中表達的多組氨酸標記蛋白的高性能純化的理想選擇。

操作說明：1. Buffer 的準備2. 樣品處理：細菌或酵母表達的蛋白(1) 挑取單菌落到培養(yǎng)基，根據載體使用說明加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。(2) 表達結束后，收集菌液至離心管中，7000 rpm，離心 15 分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。隨后加入 1/10 體積的 Lysis Buffer 和蛋白酶抑制劑。加入溶菌酶 (工作液濃度為 0.2-0.4 mg/mL；如果表達的宿主細胞內含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶)，需確認加入的蛋白酶抑制劑不會影響目的蛋白與 Agarose的結合。(3) 將菌體沉淀重懸混勻 (如果菌液濃度高，也可選擇加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I)，放置在冰上，然后冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。(4) 將澄清的破碎液轉移至離心管中，10000 rpm，4℃ 離心 20-30 分鐘。取上清，置于冰上備用或 -20℃ 保存。酵母、昆蟲和哺乳動物分泌表達可溶性蛋白(1) 將細胞培養(yǎng)液收集至離心管中，5000 rpm，離心 10 分鐘，取上清，棄沉淀，如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質，可直接加入柱子進行后續(xù)操作；如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質，需用 1×PBS 在 4℃ 條件下經透析后才能加入柱子。(2) 對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，用 1×PBS 在 4℃ 條件下經透析后才能加入柱子。包涵體蛋白 (變性條件)(1) 將培養(yǎng)液收集至離心管中，7000 rpm，離心 15 分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。(2) 按照菌體: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例將菌體重懸混勻，冰浴超聲破碎。(3) 將破碎液轉移至離心管中，10000 rpm，4℃ 離心 20-30 分鐘。棄上清，重復步驟 (2) 和步驟 (3) 一次。(4) 按照菌體: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例將包涵體懸浮起來。(5) 變性條件下進行His標簽重組蛋白純化操作。3. Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 的裝填：(1) 用去離子水沖洗柱底篩板，確保柱底篩板上無氣泡，關閉柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去離子水。(2) 將 Agarose 懸浮混勻，小心地將漿液連續(xù)地倒入柱管中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產生。(3) 打開柱底部出口，最初讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，得到很好的裝填效果。當柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上 3 倍柱體積的去離子水。標記柱床高度。(4) 關閉柱底部出口。4. 樣品純化：(1) 平衡：使用至少 5 倍柱體積的 Lysis Buffer 平衡層析柱。(2) 上樣：利用泵或注射器上樣。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或使用濾膜 (0.22 μm 或 0.45 μm)過濾。(3) 洗雜：用 Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線 (一般至少 10-15 倍柱體積)，收集流出組分和洗雜部分。注：在平衡緩沖液加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。(4) 洗脫：用 Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常 5 倍柱體積洗脫液就足夠了；線性梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如 20 倍柱體積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。(5) SDS-PAGE 檢測：將純化得到的樣品 (包括流出組分、洗雜部分和洗脫部分)以及原始樣品使用 SDS-PAGE 檢測純化效果。5. 在位清洗 (Cleaning-in Place, CIP)：(1) 去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類：使用 5-10 倍柱體積的 30% 異丙醇清洗，接觸時間為 15-20 分鐘可以去除此類污染物，然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液清洗 2 倍柱體積。去污劑處理后，需要使用 5 倍柱體積的 70% 乙醇清洗，達到除去污劑的效果。最后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。(2) 去除離子作用結合的蛋白：使用 1.5 M NaCl 溶液清洗，接觸時間為 10-15 分鐘，然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。6. 填料再生：當 His 標簽重組蛋白純化填料使用過程中發(fā)現顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要對填料進行鎳離子剝離和鎳離子重掛，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和鎳離子重掛。(1) 加入 2 倍柱體積的 0.2 M 醋酸溶液 (含 6 M GuHCl ) 清洗一次。(2) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(3) 加入 3 倍柱體積的 2% SDS 清洗一次。(4) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(5) 加入 5 倍柱體積的無水乙醇清洗一次。(6) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(7) 加入 5 倍柱體積的 100 mM EDTA (pH 8.0) 清洗一次。(8) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(9) 加入 5 倍柱體積的 100 mM NiSO4 清洗一次。(10) 加入 10 倍柱體積的去離子水清洗一次。(11) 填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20% 的乙醇中，置于 4℃ 保存。

注意事項：1. 請勿干燥或冷凍本產品，以免引起效價降低，降低純化效率。2. 本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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