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今天推來自西方大學(xué)醫(yī)學(xué)生物物理學(xué)系成像研究實(shí)驗(yàn)室和勞森健康研究所在2018年發(fā)表于Cell Discovery(2018IF：4.321，JCRQ2)的一篇文章，通訊作者是John J. Kelly和 John A. Ronald教授。

文章摘要

表達(dá)成像報(bào)告基因的細(xì)胞的無創(chuàng)分子遺傳成像是一種在臨床前模型和患者中縱向監(jiān)測癌細(xì)胞的生物分布和活力以及基于細(xì)胞的療法的寶貴方法。然而，用報(bào)告基因標(biāo)記細(xì)胞通常依賴于使用將報(bào)告基因隨機(jī)整合到基因組中的基因轉(zhuǎn)移方法，這可能會(huì)導(dǎo)致不必要的甚至嚴(yán)重的不利影響。為了克服這個(gè)問題，我們開發(fā)了 CRISPR-Cas9 工具來編輯腺相關(guān)病毒位點(diǎn) 1 (AAVS1) 安全港的細(xì)胞，其中包含編碼抗生素抗性基因和報(bào)告基因的大型供體構(gòu)建體 (*6.3 kb) 用于生物發(fā)光 (BLI)和熒光成像。HEK293T 細(xì)胞在一個(gè)質(zhì)粒中用編碼 Cas9 核酸內(nèi)切酶和 AAVS1 靶向引導(dǎo) RNA 的雙質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染，以及編碼嘌呤霉素抗性基因、tdTomato 和螢火蟲熒光素酶的供體質(zhì)粒，兩側(cè)是 AAVS1 同源臂。分離嘌呤霉素抗性克隆細(xì)胞，并通過 PCR 和 PCR 產(chǎn)物測序確認(rèn) AAVS1 整合。體外 BLI 信號(hào)與細(xì)胞數(shù)密切相關(guān) (R2 = 0.9988; p < 0.05) 并且在多個(gè)傳代中保持穩(wěn)定。將工程細(xì)胞 (2.5·106) 注射到裸鼠的左后腹，并在第 0、7、14、21 和 28 天進(jìn)行體內(nèi) BLI。BLI 信號(hào)從第 0 天到第 7 天呈下降趨勢，但到第 28 天，由于細(xì)胞生長顯著增加 (p < 0.05)。這描述了第一個(gè)用于 AAVS1 整合大基因構(gòu)建體的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，用于體內(nèi)細(xì)胞的分子遺傳成像。隨著進(jìn)一步的發(fā)展，包括提高編輯效率、使用臨床相關(guān)報(bào)告基因，以及對(duì)其他可以在培養(yǎng)中容易擴(kuò)增的細(xì)胞群(例如永生化細(xì)胞或 T 細(xì)胞)進(jìn)行評(píng)估，這種 CRISPR-Cas9 報(bào)告基因系統(tǒng)可以廣泛應(yīng)用于多項(xiàng)體內(nèi)細(xì)胞追蹤研究。

研究背景

基于報(bào)告基因 (RG) 的細(xì)胞成像，也稱為分子遺傳成像，可以提供有關(guān)移植細(xì)胞在活體中的運(yùn)輸、生物分布、活力和持久性的重要信息?？捎玫?RG 范圍涵蓋臨床前成像模式從熒光成像和生物發(fā)光成像 (BLI) 到磁共振成像、光聲斷層掃描和正電子發(fā)射斷層掃描 (PET) 等臨床模式。在疾病的臨床前模型中，基于 RG 的細(xì)胞跟蹤已經(jīng)對(duì)疾病特征產(chǎn)生了重要的前瞻性，例如癌癥轉(zhuǎn)移和新療法對(duì)轉(zhuǎn)移性病變的治療效果，以及治療細(xì)胞向特定疾病位點(diǎn)的活力和遷移。細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞在高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者中的活力。

RG 細(xì)胞成像涉及將 RG 整合到細(xì)胞的基因組中，以便在細(xì)胞的整個(gè)生命周期或任何潛在子細(xì)胞的生命周期內(nèi)穩(wěn)定地產(chǎn)生報(bào)告蛋白。這些報(bào)告產(chǎn)物的檢測提供了有關(guān)細(xì)胞位置/數(shù)量和細(xì)胞活力隨時(shí)間推移的重要間接信息。此外，基于如何調(diào)節(jié) RG 表達(dá)，例如使用哪個(gè)啟動(dòng)子。人們可以獲得有關(guān)細(xì)胞活化和/或分化的信息。雖然這是非常寶貴的信息，但也存在一個(gè)問題，工程過程中，與幼稚的細(xì)胞相比，細(xì)胞的行為可能會(huì)發(fā)生改變。例如，慢病毒載體是一種流行的工程細(xì)胞載體，因?yàn)樗鼈兙哂写蟮霓D(zhuǎn)基因能力，并且能夠容易地轉(zhuǎn)導(dǎo)多種分裂和非分裂細(xì)胞類型。然而，與大多數(shù)整合載體一樣，慢病毒載體在準(zhǔn)引入基因隨機(jī)基因組位點(diǎn)有可能導(dǎo)致不想要的事件，例如癌基因激活差異剪接、通讀轉(zhuǎn)錄和異常轉(zhuǎn)錄。因此，在特定基因組區(qū)域設(shè)計(jì)具有 RG 的細(xì)胞的新穎、相對(duì)易于使用的工具將避免這些問題并具有很大的價(jià)值。

基因組編輯工具已經(jīng)存在了幾十年，它允許將感興趣的轉(zhuǎn)基因整合到特定的基因組位點(diǎn)。其中兩種工具，鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALENs)。是成熟的基于蛋白質(zhì)的系統(tǒng)，可在特定基因組位點(diǎn)引入雙鏈斷裂(DSB)。然后將編碼目的轉(zhuǎn)基因并通過同源臂連接到切割位點(diǎn)的供體 DNA 構(gòu)建體共同引入可用于位點(diǎn)通過同源定向修復(fù) (HDR) 進(jìn)行定向整合。許多團(tuán)隊(duì)已經(jīng)利用這種策略來整合不同的 RG。此外，隨著安全基因組基因座的發(fā)現(xiàn)，研究人員有機(jī)會(huì)使用這些編輯工具進(jìn)行安全轉(zhuǎn)基因。例如，幾個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)用 RG 改造了細(xì)胞在腺相關(guān)病毒整合位點(diǎn) 1 (AAVS1) 使用 ZFN 和 TALEN。這是一個(gè)安全港，轉(zhuǎn)基因可以在不影響內(nèi)源基因活性的情況下以可預(yù)測的方式整合和發(fā)揮作用。這一策略為消除任何潛在的有害影響打開了大門，但 ZFN 和 TALEN 的一個(gè)缺點(diǎn)是它們的設(shè)計(jì)和構(gòu)造具有挑戰(zhàn)性且昂貴，這限制了它們的廣泛使用。

CRISPR* 和 CRISPR 相關(guān)蛋白 9 (Cas9) 于 2013 年成為基因組編輯工具，因?yàn)樗?ZFN 和 TALEN 更容易設(shè)計(jì)且實(shí)施成本更低。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)利用 Cas9 核酸內(nèi)切酶除了引導(dǎo) RNA (gRNA) 之外，還可以在基因組的特定位點(diǎn)引入 DSB。這兩個(gè)組件可以在單個(gè)質(zhì)粒中編碼，當(dāng)與供體質(zhì)粒配對(duì)時(shí)，還可以在感興趣的位點(diǎn)進(jìn)行基于 HDR 的轉(zhuǎn)基因整合。重要的是，CRISPR/Cas9 也被證明比以前使用的編輯工具具有更高的效率。它還具有簡單的設(shè)計(jì)、高特異性和相對(duì)較高的效率，使其成為靶向整合 RG 的有前途的方法，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行惰性、安全和有效的分子遺傳成像。這項(xiàng)研究的目的是開發(fā)一種新的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，以在 AAVS1 安全港對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造，以共同表達(dá)選擇標(biāo)記和雙模式 RG，并利用分子-基因成像。

方法和材料

AAVS1 靶向 CRISPR-Cas9 和供體質(zhì)粒

pCas-Guide-AAVS1、pCas-Guide-Scramble 和 pAAVS1-puroDNR 構(gòu)建體購自商業(yè)供應(yīng)商 (OrigeneRockvilleMD)。pCas-Guide-AAVS1 質(zhì)粒包含驅(qū)動(dòng) Cas9 核酸內(nèi)切酶表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子 (pCMV)基因和 U6 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)靶向 AAVS1 位點(diǎn)的 gRNA 表達(dá)。pCas-Guide-Scramble 質(zhì)粒類似，但編碼的 gRNA 不靶向任何特定的基因組位點(diǎn)。pAAVS1-puroDNR 質(zhì)粒包含左側(cè)和與 AAVS1 位點(diǎn) CMV 增強(qiáng)劑和磷酸甘油酸激酶 1 啟動(dòng)子 (pPGK) 的右同源臂，驅(qū)動(dòng)嘌呤霉素抗性基因的表達(dá)。先前在 Ronald 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 LV pEF1a-tdT-P2A-Luc2 載體包含人延伸因子 la 啟動(dòng)子 ( pEF1α) 驅(qū)動(dòng)熒光 RGtdTomato (tdT) 和產(chǎn)生螢火蟲螢光素酶蛋白 (FLuc) 的密碼子優(yōu)化的生物發(fā)光 RG 螢火蟲螢光素酶 (Luc2) 的表達(dá)。高效自切割豬 teschovirus-1 肽 (P2A)27. pEF1a-tdT-P2A-Luc2 盒通過 PCR 擴(kuò)增并使用融合克隆 (Takara Bio, Mountain View, CA) 克隆到 pAAVS1-puroDNR 構(gòu)建體中用 ApaI 和 FseI (New England Biolabs Inc, Ipswich MA) 消化 pAAVS1-puroDNR。這種新的供體載體被稱為 pAAVS1-puro pEF1α-tdT-P2A-Luc2-DNR。

細(xì)胞和細(xì)胞工程

人胚胎腎 (HEK293T;ATCC Manassas VA) 細(xì)胞維持在 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 (Thermo Fisher OntarioCA) 中，該培養(yǎng)基含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/鏈霉素，37C 和 5% CO2。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種在六孔中板，密度為每孔 7x10 個(gè)細(xì)胞。按照制造商的建議，用 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)?；?pAAVS1-puro-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 和 pCas-Guide 打亂質(zhì)粒各 0.5 ug，與 1 uL P3000 試劑、50 uL Opti-MEM 培養(yǎng)基和 0.75 uL Lipofect amine 3000 混合。轉(zhuǎn)染嘌呤霉素后 12 天將tibiotic(0.6ug / mL)添加到生長培養(yǎng)基中，并通過每天更換培養(yǎng)基來維持嘌呤霉素選擇7天。由此產(chǎn)生的嘌呤霉素抗性細(xì)胞群稱為我們的混合細(xì)胞群(MCP)。

AAVS1 整合分析

使用 DNeasy Blood and Tissue 試劑盒(QIAGEN Ontario, CA)從 MCP 中提取基因組 DNA(gDNA)。為了檢測 AAVS1 位點(diǎn)的整合，制作引物以 PCR 擴(kuò)增同源外 AAVS1 基因組位點(diǎn)之間的 5 和 3 連接。為5'連接設(shè)計(jì)的PCR引物為：5-AGGCAGGTCC TGCTTTCTCTGAC-3(正向引物與AAVS1位點(diǎn)互補(bǔ))和5-TGCCTGCTCTTTACTGAA GGCTC-3(與嘌呤霉素抗性基因互補(bǔ))，潛在1.1 kb PCR 產(chǎn)物：對(duì)于 3iunction 是 5'-CCTGGAAGTTG CCACTCCAG-3(與供體盒中的 poly A 尾互補(bǔ)的正向引物)和 5-AAGGC AGCCTGGTAGACAGG-3'(與 AAVS1 位點(diǎn)互補(bǔ)的反向引物)，潛在 1.4kb PCR 產(chǎn)物。在確認(rèn) AAVS1 引導(dǎo) MCP 包含正確編輯的細(xì)胞后，將 MCP 連續(xù)稀釋以在 96 孔板的每個(gè)孔中獲得單個(gè)細(xì)胞。在細(xì)胞擴(kuò)增后，我們從每個(gè)克隆群體中分離出 DNA使用與 MCP 相同的 PCR 引物再次評(píng)估 QuickExtract DNA 提取溶液(EpicentreMadisonWand AAVS1 整合。使用 Nucleospin 凝膠和PCR 凈化試劑盒(Macherey NagelDuren Germany)和 PCR 產(chǎn)物在倫敦區(qū)域基因組學(xué)中心(Robarts Research Institute,London,ONCanada)進(jìn)行測序。

報(bào)告基因功能

為了評(píng)估 tdTRG 功能，使用 EVOS FL aut 2 顯微鏡(Thermo Fisher Scientific)獲得熒光圖像。BLI 實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行并用于評(píng)估 Luc2 RG 功能 BLI 信號(hào)和細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系，以及不同細(xì)胞傳代中的 Luc2 RG 表達(dá)水平數(shù)字。為了評(píng)估 Luc2 RG 功能以及 BLI 信號(hào)和細(xì)胞編號(hào)之間的關(guān)系，將 HEK293T 細(xì)胞以每孔 1x1045x101x101.5x10 和 2.5x10 個(gè)細(xì)胞的濃度接種在 24 孔板中。為了評(píng)估增加細(xì)胞傳代數(shù)對(duì) Luc2 RG 表達(dá)的影響，將 5x10 細(xì)胞接種在 81012 和 14 代的 24 孔板中。對(duì)于所有板的 BLI，將 5 μL D-熒光素(0.1 mg/mL Perkin Elmer，Waltham MA)添加到每口井在使用混合光學(xué)/X 射線掃描儀(IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System;PerkinElmer)收集圖像前 5 分鐘。使用 LivingImage 軟件(PerkinElmer)分析 BLI 信號(hào)以確定平均輻射亮度(p/s/cm/ sr) 每口井。

動(dòng)物研究

以下協(xié)議是按照加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)和西方大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用的指南進(jìn)行的。本研究使用 6-8 周大的雌性 NUNUnude 小鼠 (NU-Foxn1n=5) ( Charles Rivers，Wilmington，MA)。每只小鼠在左后腹皮下注射 2.5x10Clone 10 HEK-293T 細(xì)胞。在第 037、14、21 天，在與上述相同的混合光學(xué)/X 射線掃描儀上進(jìn)行 BLI，和28 只注射后的小鼠用 100% 氧氣中的 2% 異氟醚麻醉，使用連接到活性炭過濾器上的鼻錐。麻醉小鼠腹膜內(nèi)注射 150uL D 熒光素 (30mg/mL) 并捕獲生物發(fā)光圖像長達(dá)45 分鐘。使用 LivingImage 軟件 (PerkinElmer) 分析 BLI 信號(hào)，并通過在植入部位上繪制感興趣區(qū)域來確定平均輻射 (p/sec/cm/sr)。45 分鐘成像期間的峰值平均輻射用于在每個(gè)成像時(shí)間點(diǎn)對(duì)每只小鼠進(jìn)行量化。

組織學(xué)

在終點(diǎn)處，通過異氟醚過量處死小鼠，并從左后腹取出HEK293T生長組織。將組織固定在 4% 多聚甲醛中，然后在 30% 蔗糖的 PBS 中冷凍保存 24 小時(shí)。冷凍保存后，將組織浸入最佳切割溫度并使用液氮冷凍。使用 Leica CM350 低溫恒溫器系統(tǒng)(Leica BiosystemsWetzlarGer)進(jìn)行冷凍切片許多)以獲得 14um 冷凍切片。冷凍切片用兔抗螢火蟲熒光素酶一抗(ab21176Abcam，Cambridge，UK)和山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗(ab150077 Abcam)染色，以評(píng)估 FLuc 的存在或僅用山羊抗兔 alexa fluor 488 二抗作為 FLuc 存在的對(duì)照，以及用于定位細(xì)胞核的 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 使用 ZeissLSM800 共聚焦顯微鏡(ZeissOberkochenGermany)對(duì)切片進(jìn)行成像。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

使用 GraphPad PRISM 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為了比較接種的細(xì)胞數(shù)與體外 BLI 信號(hào)，我們進(jìn)行了 Pearson 相關(guān)測試。為了評(píng)估體外 BLI 信號(hào)與傳代次數(shù)的差異，我們進(jìn)行了 Tukey 的多重比較測試。為了評(píng)估體內(nèi) BLI 信號(hào)隨時(shí)間的差異，我們使用具有事后多重比較檢驗(yàn)的弗里德曼檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)的 p 值為 0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究內(nèi)容

1.使用 CRISPR/Cas9 多模態(tài)報(bào)告基因 (RG) 系統(tǒng)在 AAVS1 位點(diǎn)改造細(xì)胞

pAAVS1-puro-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR質(zhì)粒被開發(fā)用于與pCas Guide-AAVS1質(zhì)粒結(jié)合使用，將多個(gè)成像RG(tdT和Luc2)整合到細(xì)胞的AAVS1安全基因組港中。pAAVS1-puro-pEF1a-tdTP2A-Luc2-DNR, pCas-guide-AAVS1, 和pCas-GuideScramble的質(zhì)粒主要特點(diǎn)分別如圖 1A-C 所示。為在細(xì)胞的 AAVS1 位點(diǎn)實(shí)現(xiàn) RG 表達(dá)而進(jìn)行的基因組編輯步驟如圖 1D 所示。

為了確定 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是否可以有效地編輯具有大 RG 構(gòu)建體(~6.3kb)的細(xì)胞的 AAVS1 位點(diǎn)，將 HEK293T 細(xì)胞與 pCas-Guide-AAVS1 和 pAAVS1-puro pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染或 pCas-Guide Scramble 和 pAAVS1-pur-pEF1a-tdT-P2A-Luc2-DNR 質(zhì)粒。正如預(yù)期的那樣，兩種轉(zhuǎn)染都產(chǎn)生了嘌呤霉素抗性細(xì)胞群，但我們使用 5' 基因組 - 供體盒連接處的引物進(jìn)行的 PCR AAVS1 整合測試(圖 2A)揭示了僅在與 AAVS1 靶向 gRNA 共轉(zhuǎn)染的 MCP 中的條帶(圖 2B). 然后建立和擴(kuò)了 26 個(gè)克隆細(xì)胞群，并使用 PCR 分析測試在 AAVS1 位點(diǎn)的整合。在測試的 26 個(gè)克隆中，只有第 10 個(gè)克隆群(HEK293T 克隆 10)顯示供體盒整合到AAVS1 位點(diǎn)使用引物組用于 3 和 5 基因組供體盒連接。因此正確編輯的嘌呤霉素抗性細(xì)胞百分比為 3.8%。PCR 產(chǎn)物的凝膠提取和測序揭示了預(yù)期的 DNA 序列，進(jìn)一步驗(yàn)證了 AAVS1 編輯在這個(gè)細(xì)胞群中使用我們的供體盒(圖 2D，E)。

在克隆群體中的 AAVS1 位點(diǎn)編輯確認(rèn)后，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)以確定整合的 RGs 是否在這些細(xì)胞中起作用。HEK293T 克隆 10 細(xì)胞的明場和熒光圖像顯示功能性 tdTex - 表達(dá)(圖 3A)。每孔不同數(shù)量的細(xì)胞(1x10、5x10、1x101.5x10 和 2.5x105)也用 BLI 成像以可視化 Luc2 表達(dá)(圖 3)。3B)，細(xì)胞數(shù)與BLI信號(hào)呈顯著正相關(guān)(p<0.05：r2=0.9988;圖3c)。隨著傳代數(shù)增加的細(xì)胞bli(pp10p12p14)bli信號(hào)無顯著差異(p>0.05，圖 3D)。

2. AAVS1 編輯細(xì)胞的縱向體內(nèi) RG 成像

接下來，我們進(jìn)行了體內(nèi) BLI，以評(píng)估 AAVS1 編輯的細(xì)胞的生存能力超時(shí)。將 HEK293Tclone10 細(xì)胞 (2.5x10°) 注射到裸鼠的左后腹，并在注射后第0，3，7，14，21，和28 天進(jìn)行 BLI。到第 7 天，在五只小鼠中的一只中觀察到 BLI 信號(hào)的喪失(代表活細(xì)胞的喪失)，因此該小鼠被排除在其余的成像時(shí)間點(diǎn)之外。在其余四只小鼠的所有時(shí)間點(diǎn)獲得的每個(gè) BLI 圖像中都可以檢測到信號(hào)。圖 4A 顯示了隨著時(shí)間的推移為一只小鼠采集的代表性圖像。從第 0 天到第 7 天觀察到 BLI 信號(hào)下降，這可能是由于細(xì)胞死亡，隨后隨著細(xì)胞在后側(cè)形成團(tuán)塊而 BLI 信號(hào)增加。這種趨勢在所有四只小鼠的信號(hào)丟失和復(fù)發(fā)是一致的，所有四只小鼠的平均 BLI 信號(hào)從第 7 天到第 28 天顯著增加(p<0.05;圖 4B)。

結(jié)論與討論