樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DCs）在天然識(shí)別病原體和隨后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的活化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DCs通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞抗原肽來誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和分化，從而啟動(dòng)適應(yīng)性反應(yīng)。DC還可分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，增強(qiáng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。除了活化Naive T細(xì)胞的作用外，DCs被認(rèn)為在引導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞的分化以及T細(xì)胞耐受性的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。雖然DCs存在于體內(nèi)多種組織中，但含量很少，無法滿足科學(xué)研究和臨床治療的需要， 所以學(xué)者們嘗試多種方法來體外培養(yǎng)和擴(kuò)增DC。對(duì)于人DCs的獲得，常用的方法是從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）誘導(dǎo)產(chǎn)生。而對(duì)于小鼠，最常見的方法是從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生, 即骨髓來源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）。

鑒于功能分析和分子生物學(xué)研究的需要，獲得更高數(shù)量和更高純度的BMDCs是大家一直追求的目標(biāo)。碧芯生物特邀海南醫(yī)學(xué)院的張老師與大家分享BMDCs的經(jīng)典制備方法(Lu, Zhang et al. 2021)，大家可根據(jù)自身需要選擇使用，因?yàn)樵噭┑钠放?，貨?hào)可能對(duì)BMDCs的制備質(zhì)量具有很大的影響，因此，我們列出了所用的所有試劑的品牌及貨號(hào),以供參考。

1.     試劑的準(zhǔn)備

1)   BMDCs培養(yǎng)基：取10 mL胎牛血清（Gibco，貨號(hào)：1932597），加入90 mL        RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066），加入β-巰基乙醇               （Amresco，貨號(hào)：0482）使得終濃度為50 µM ，具體為取10 µL β-巰基乙醇        加入到1 mL PBS（博士德，貨號(hào)：PYG0021），混勻后再從中取出34 µL，         加入至上述的100 mL培養(yǎng)基中即可。

2)  GM-CSF： GM-CSF是成功獲得BMDCs的關(guān)鍵試劑，我們實(shí)驗(yàn)室選用的abcam的小鼠重組GM-CSF（abcam貨號(hào)：ab9742），預(yù)先配制成2 µg/mL的溶液并分裝保存在-80 ^oC：取20 µg GM-CSF，先用 10 mL 含10% FBS（Gibco，Lot：193259）的RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066）溶解，用無菌無內(nèi)毒素的1.5離心管分裝成每管100 µL，放置于-80 ^oC。

2.     獲得BMDCs

1)    取C57bl/6j小鼠一只，頸椎脫臼法處死，并在消毒酒精中浸泡2分鐘，在超凈工作臺(tái)中手術(shù)取出所有股骨和脛骨并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈，浸泡在2 mL PBS中（PBS置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，貨號(hào)：13418002 ）中的一孔）；將骨移入6孔板中的另一個(gè)盛有2 mL PBS的新孔中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨*變白；收集骨髓懸液，并用45微米細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾（Jet Biofil，貨號(hào)：CSS010040），收集細(xì)胞懸液，1000 g離心3分鐘，棄上清，往沉淀中加入1 mL紅細(xì)胞裂解液（Biosharp，貨號(hào)：69015473），輕輕吹打使細(xì)胞分散，1分鐘后1000 g離心3分鐘，棄上清，沉淀用PBS（博士德，貨號(hào)：PYG0021）洗滌一次，最終用2 mL BMDCs培養(yǎng)基分散，并將細(xì)胞分散液轉(zhuǎn)移至直徑為90 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿（Nest，貨號(hào)：752001）中，再補(bǔ)入6 mL BMDCs培養(yǎng)基，加入80 µL預(yù)先配好的GM-CSF溶液(2 µg/mL)使終濃度至20 ng/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱（37 oC， 5% CO2）中培養(yǎng)48小時(shí)。

2)   48 h后，再加入8 mL BMDCs培養(yǎng)基以及 80 µL GM-CSF （2 µg/mL）,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)；

3)   72 h后，換液，并加入80 µL GM-CSF (2 µg/mL)。 注意上清中的細(xì)胞不要丟棄。我們的做法如下：將上清轉(zhuǎn)移至15 mL無菌離心管中（Corning，貨號(hào)：15620023）,1000 g離心3分鐘，棄上清，細(xì)胞用8 mL BMDCs分散再加回至原細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再加入GM-CSF 80 µL，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4)    24 h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，小心晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿使懸浮細(xì)胞分散均勻，取出含有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液離心（注意不要收集貼壁細(xì)胞），棄去上清，細(xì)胞用含有10%FBS的1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066）分散并測(cè)定細(xì)胞濃度，并接種在細(xì)胞培養(yǎng)板上，細(xì)胞培養(yǎng)板的尺寸根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)確定。此時(shí)獲得的BMDC細(xì)胞為未成熟的DC細(xì)胞。

5)       加入LPS（Sigma， SMB00610）刺激24 h，我們就可以獲得成熟的BMDCs細(xì)胞。

圖1 BMDCs制備方法示意圖

3鑒定BMDCs

如何鑒定獲取了的BMDCs細(xì)胞并誘導(dǎo)了DC細(xì)胞的成熟呢？本實(shí)驗(yàn)室一般通過用熒光標(biāo)記的CD11c以及CD80、CD86染色，再用流式細(xì)胞技術(shù)，通過CD11c陽性細(xì)胞的比例明確BMDCs的純度，通過CD80、CD86雙陽的比例明確成熟BMDCs的比例。

此外，我們還通過對(duì)比無藥物刺激與LPS刺激BMDCs 24 h后，二者的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化來確定BMDCs是否成功獲取以及成熟狀態(tài)。對(duì)于細(xì)胞因子檢測(cè)方面，要同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清中多個(gè)細(xì)胞因子的含量，采用ELISA工作量較大，且細(xì)胞上清有時(shí)可能不夠，因此使用碧芯生物科技有限公司的Beadstar-mPlex^TM小鼠多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BS-MC01）可以滿足一次檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞因子的需要。通過流式細(xì)胞技術(shù)，只需要25 µL樣本，就可以同時(shí)檢測(cè)IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等多個(gè)細(xì)胞因子的濃度。附圖為無藥物刺激與LPS刺激DC細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度（采用Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒測(cè)得）。

圖2. 無藥物刺激與LPS刺激BMDCs細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度

參考文獻(xiàn)：

Lu, Z., Y. Zhang, et al. (2021). "A biotin-avidin-system-based virus-mimicking nanovaccine for tumor immunotherapy." Journal of Controlled Release 332: 245-259.