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 MYC-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：MNM-25-1000

儲存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封)，避免離心，干燥和凍融。

產品描述

偶聯anti-Myc-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀Myc-tag (EQKLISEEDL)融合蛋白。

產品優(yōu)勢

l沒有普通抗體的輕鏈和重鏈，背景干凈；

l即用型，節(jié)約時間；

l高親和力，高載量。

應用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質譜分析等。

特異性

特異性結合位于融合蛋白N-端、C-端及內部的Myc-tag。不結合內源性c-Myc。

產品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封)，避免離心，干燥和凍融。

實驗原理

實驗步驟

收集細胞
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達Myc-tag融合蛋白的細胞，可根據Myc-tag融合蛋白表達量適當調整細胞數。

吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細胞裂解

1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2.置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。

3.4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產物（上清）轉移到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞裂解產物可長期保存于-80℃。

平衡珠子

4.充分混勻Myc-Nanoab-Magnetic Beads，吸取40μl該產品到500μl預冷的裂解緩沖液中，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。（此步驟可選）

結合蛋白

5.將平衡好的Myc-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產物中（如果未做第4步，可在細胞裂解產物中直接加入40μl該產品），于4℃旋轉混合結合1小時。根據實驗需要可調整結合時間。如果需要，留存50μl的裂解產物進行免疫印跡分析。

6.在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子

7.用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的Myc-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液并重復清洗3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白

方法一：
8.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Myc-Nanoab-Magnetic Beads。95℃，加熱10min充分變性，在磁力架上進行分離，收集的產物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：
9.加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，在磁力架上進行分離并收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。

方法三：

10.加入40µM Myc-peptide進行洗脫。

可選實驗方案

方案一：
如需進行Myc融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Myc融合蛋白的蛋白質/DNA相互作用的實驗。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，聯反應的逆轉，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第5步，加入細胞裂解產物后，DNA-蛋白質復合物結合到Myc-Nanoab-Magnetic Beads上；
進入第6和7步，分離得到復合物；進入第9步，得到洗脫的復合物；后期交聯反應的逆轉，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
Myc-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質譜技術鑒定未知蛋白。