MBP 標(biāo)簽親和填料 （麥芽糖結(jié)合蛋白）

產(chǎn)品貨號：M1050

儲存條件：2-8 °C

產(chǎn)品簡介

Dextrin Beads 6FF 是一種純化帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP）標(biāo)簽蛋白的親和層析介質(zhì)，具體性能見表1。MBP可促進連接蛋白的正確折疊，增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。Dextrin Beads 6FF可以一步純化MBP融合蛋白，結(jié)合的融合蛋白可以用10 mM麥芽糖進行溫和洗脫，保護了標(biāo)簽蛋白的活性。如果要去除MBP融合部分可用位點特異性蛋白酶切除。

表 1 Dextrin Beads 6FF 產(chǎn)品性能

純化流程

1. 緩沖液的準備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 um或0.45 um濾膜過濾。

平衡/洗雜液: 20 mM Tris-HCI，200 mM NaCl，1 mM EDTA，pH7.4

洗脫液: 20 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，10 mM麥芽糖，pH7.4

注意: 平衡液和洗脫液中可加入1 mM DTT或10 mM β-疏基乙醇

2. 樣品準備

樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾，減少雜質(zhì)，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

3 Dextrin Beads 6FF裝填

3.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將Dextrin Beads 6FF混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中(介質(zhì)實際體積占懸液的一半)，打開下出口流干保護液。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，2-8℃保存。

3.2中壓層析柱的裝填

Dextrin Beads 6FF被廣泛應(yīng)用于工業(yè)純化，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝，下面介紹填裝層析柱的方法。裝柱前根據(jù)層析柱直徑計算柱子底面積，根據(jù)所需裝柱高度計算所需介質(zhì)體積，公式如下:

V = 1.15πr²h  (V：所需介質(zhì)體積ml；1.15：壓縮系數(shù)；r：柱管半徑cm；h：裝填高度cm）

注意：所取懸液體積應(yīng)為介質(zhì)體積的兩倍，因為介質(zhì)體積只占懸液總體積的一半，另一半為保護液。

1） 用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去離子水。

2） 將介質(zhì)懸浮起來，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3） 如果使用儲液器，應(yīng)立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進樣管中產(chǎn)生氣泡。

4） 打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設(shè)定的流速下進行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達不到推薦的壓力或流速，可以用所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個很好的裝填效果。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5） 關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6） 如果使用儲液器，去除儲液器，將分配器置于層析柱中。

7） 將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭。

8） 將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

4. 樣品純化流程

4.1孵育法純化

1） 根據(jù)純化樣品量，取適量Dextrin Beads 6FF加入離心管中，1000rpm離心1 min,吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護液。

2） 向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的平衡液清洗介質(zhì)，1000rpm離心1 min,吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重復(fù)兩次以上。

3） 加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4） 孵育結(jié)束后，1000 rpm離心1 min,吸棄上清，或過濾收集介質(zhì)，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。

5） 用5倍介質(zhì)體積的洗雜液清洗介質(zhì)，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到介質(zhì)），重復(fù)3-5次，中間建議更換新離心管。

6） 加入3-5倍柱體積的洗脫液進行洗脫，室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復(fù)2-3次。

4.2重力柱法純化

1） 將裝填好的Dextrin Beads 6FF重力柱用5倍柱體積平衡液進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復(fù)2-3次。

2） 將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質(zhì)充分接觸，收集流出液，可

以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3） 用10-15倍柱體積的洗雜液進行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4） 使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫，又可以得 到高純度和高濃度的蛋白。

4.3中壓層析柱法純化

Dextrin Beads 6FF裝填好后，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1） 將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，并旋緊。

2） 用3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。

3） 使用至少5倍柱床體積的平衡液平衡色譜柱。

4） 利用泵或樣品環(huán)上樣。

注:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少，也會導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓，使得進樣器更難使用。

5） 用洗雜液沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）。

6） 使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

上述步驟洗脫結(jié)束后，用平衡液沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積，再用保護液沖洗2個柱體積，然后將介質(zhì)置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

6. 填料清洗

Dextrin Beads 6FF純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無需再生，但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和結(jié)合載量都下降，這時可按照下面方法對填料進行清洗。

1）3倍柱體積的去離子水;

2）3倍柱體積的0.1% SDS或0.1 M NaOH溶液;

3）3倍柱體積去離子水，20%乙醇2-8℃保存。