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線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)

產(chǎn)品貨號：J22202

儲存條件： -20℃避光保存，并盡量避免反復(fù)凍融。超純水和 JC-1染色緩沖液(5X)也可 4℃保存。

產(chǎn)品描述：

JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以 JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測，也是用來檢測細(xì)胞早期凋亡的常用方法。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針，JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585nm, Em=590nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1 不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。觀察時，只需使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

線粒體膜電勢的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個標(biāo)志性事件。細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細(xì)胞se素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸內(nèi)切酶G（EndoG）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等從線粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞se素C的釋放伴隨膜電位的*喪失，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡酶的級聯(lián)效應(yīng)。

本試劑盒提供了CCCP作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200個樣品。

使用說明：

1. JC-1染色工作液的配制

六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1 mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每 50～100 萬細(xì)胞需 0.5 mL JC-1 染色工作液。取適量 JC-1（200x），按照每 50μL JC-1（200x）加入8 mL超純水的比例稀釋 JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1。然后再加入2 mL JC-1 染色緩沖液（5x），混勻后即為 JC-1  染色工作液。

2. 陽性對照的設(shè)置

把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照 1：1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中， 稀釋至 10uM，處理細(xì)胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10uM CCCP 處理20分鐘后線粒體的膜電位會*喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定或優(yōu)化體系摸索最you條件。

3.對于懸浮細(xì)胞

1）取10～60萬細(xì)胞，重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

2）加入 0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。

3）在孵育期間，按照每 1 mL JC-1 染色緩沖液（5x）加入 4 mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1  染色緩沖液（1x），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結(jié)束后，600x g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

5）用JC-1染色緩沖液（1x）洗滌 2 次：加入 1 mL JC-1染色緩沖液（1x）重懸細(xì)胞，600xg 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1 mL JC-1染色緩沖液（1x）重懸細(xì)胞，600xg 4℃離心3～4分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

6）再用適量 JC-1 染色緩沖液（1x）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4.對于貼壁細(xì)胞

對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

1）對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

2）加入 1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

3）在孵育期間，按照每 1 mL JC-1 染色緩沖液（5x）加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1x），并放置于冰浴。

4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1x）洗滌2次。

5）加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5.對于純化的線粒體

1）把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液（1x）稀釋 5 倍。

2）0.9 mL 5 倍稀釋的JC-1染色工作液中加入 0.1 mL 總蛋白量為 10～100ug 純化的線粒體。

3）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時間掃描（time scan），激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為590 nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置

為 485 nm 時，可以在 475～520 nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。

4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6.熒光觀測和結(jié)果分析

檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490 nm，發(fā)射光設(shè)置為 530 nm；

檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525 nm，發(fā)射光設(shè)置為 590 nm。

注意：

此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最da激發(fā)波長和最da發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 聚合物時可使用常來檢測碘化丙啶或者 Cy3 用的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。檢測 JC-1 單體可使用常來檢測綠色熒光化合物如 FITC 的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項(xiàng)：

1.JC-1（200x）在 4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)， 可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2.必須先把 JC-1（200x）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入 JC-1 染色緩沖液（5x）。不可先配制 JC-1 染色緩沖液（1x）再加入 JC-1（200x），這樣 JC-1 會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

3.裝載完 JC-1 后用 JC-1 染色緩沖液（1x）洗滌時，使 JC-1 染色緩沖液（1x）保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

4.JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

5.請勿把 JC-1 染色緩沖液（5x）全部配制成 JC-1 染色緩沖液（1x），本試劑盒使用過程中需直接使用 JC-1 染色緩沖液（5x）。

6.如果發(fā)現(xiàn) JC-1 染色緩沖液（5x）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。

7.CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

8.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。本品僅用于實(shí)驗(yàn)研究。

產(chǎn)品組成：