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MYC-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：MNM-25-1000

儲存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，避免離心，干燥和凍融。

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-Myc-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀Myc-tag (EQKLISEEDL)融合蛋白。

產(chǎn)品優(yōu)勢

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈，背景干凈；

即用型，節(jié)約時間；

高親和力，高載量。

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質(zhì)譜分析等。

特異性

特異性結(jié)合位于融合蛋白N-端、C-端及內(nèi)部的Myc-tag。不結(jié)合內(nèi)源性c-Myc。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保*密封)，避免離心，干燥和凍融。

實驗原理

實驗步驟

收集細胞
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 個表達Myc-tag融合蛋白的細胞，可根據(jù)Myc-tag融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù)。

吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或胰酶消化收集貼壁細胞，細胞轉(zhuǎn)移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解，為了提高裂解效率，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。

細胞裂解

1.在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細胞。

2.置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次。

3.4℃，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

平衡珠子

4.充分混勻Myc-Nanoab-Magnetic Beads，吸取40μl該產(chǎn)品到500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。（此步驟可選）

結(jié)合蛋白

5.將平衡好的Myc-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產(chǎn)物中（如果未做第4步，可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl該產(chǎn)品），于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要，留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析。

6.在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子

7.用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸6中的Myc-Nanoab-Magnetic Beads，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液并重復(fù)清洗3次。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白

方法一：
8.加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸Myc-Nanoab-Magnetic Beads。95℃，加熱10min充分變性，在磁力架上進行分離，收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：
9.加入50μl 0.2 M pH2.5的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時間30秒，期間不斷混勻，在磁力架上進行分離并收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的甘氨酸。注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步。

方法三：

10.加入40µM Myc-peptide進行洗脫。

可選實驗方案

方案一：
如需進行Myc融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，主要用于含有Myc融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細胞固定，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第5步，加入細胞裂解產(chǎn)物后，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到Myc-Nanoab-Magnetic Beads上；
進入第6和7步，分離得到復(fù)合物；進入第9步，得到洗脫的復(fù)合物；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上。
方案三：
Myc-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白。