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LNA在基因檢測中的應(yīng)用

閱讀:268      發(fā)布時間:2024-9-24
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一、LNA的介紹

鎖核酸(Locked nucleic acid,LNA)是一種經(jīng)過修飾的RNA,LNA中一部分核糖上的2'4'碳連結(jié)在一起。一般可見于A-DNARNA。這類核酸可以增加引物或探針(probe)的融解溫度(Tm值),加強這些實驗用物質(zhì)的穩(wěn)定性,可應(yīng)用在即時聚合酶連鎖反應(yīng)(real-time PCR)等技術(shù)中。近期,鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在藥學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注,有希望成為分子水平治療各種疾病的新突破口.它是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物,結(jié)構(gòu)中含有一個或多個2 ′-O,4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體,核糖的2′-O4′-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋,并連接成環(huán)形,這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內(nèi)型的N構(gòu)型,降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性,增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.由于LNADNA/RNA在結(jié)構(gòu)上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力.與其他寡核苷酸類似物相比,LNA有很多優(yōu)點:a.和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩(wěn)定性(ΔTm=3~8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性;c.LNA-DNA雜交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入細胞膜,易被機體吸收;e.體內(nèi)無毒性作用;f.高效的自動寡聚化作用,合成方法相對簡單,部分或wanquan修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動合成儀上合成。

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二、LNA在基因檢測中的應(yīng)用

1. LNA引物

用鎖核酸修飾引物大大提高了PCR的效率。PCR上游引物的3'末端經(jīng)LNA修飾后,若3"末端與模板不是互補的,則PCR擴增效率明顯降低,即LNA修飾的引物其識別錯配的能力與DNA引物相比大大提高。普通PCR實驗也證明LNA引物可產(chǎn)生較少的錯配產(chǎn)物,而DNA引物與模板發(fā)生錯配時卻有大量的錯誤產(chǎn)物擴增出。與普通的DNA引物相比,LNA引物所用聚合酶用量少,成本效率高。除此之外,LNA引物還可以減少模板用量。研究發(fā)現(xiàn),在引物中間修飾一個或三個鎖核酸效果最jia。將鎖核酸修飾在引物的3'端或5 '端或其他的位點,PCR結(jié)果顯示,鎖核酸修飾在引物5'端優(yōu)勢更明顯。

2.LNA探針

LNA(Locked Nucleic Acid)探針是一種用于核酸檢測和分析的高效探針,具有增強的特異性和穩(wěn)定性。它們通常被用于實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)、原位雜交、基因表達分析等核酸分子生物學(xué)技術(shù)中。LNA探針的特殊之處在于它們的核酸結(jié)構(gòu)中包含了Locked Nucleic Acid,即一種經(jīng)過修飾的核酸單元。LNA中的核苷酸具有特殊的構(gòu)象,其中的核苷酸環(huán)被修飾以形成一種特殊的結(jié)構(gòu),使其能夠更強烈地結(jié)合目標(biāo)DNARNA。在基因表達分析中,LNA探針可用于檢測特定基因的表達水平。通過與目標(biāo)基因雜交,LNA探針能夠準(zhǔn)確地檢測出基因的表達量,從而幫助研究人員確定基因的表達模式。這有助于揭示基因的功能和疾病的發(fā)生機制。突變檢測是LNA探針應(yīng)用的另一個重要領(lǐng)域。LNA探針可以與目標(biāo)DNA序列進行高親和力結(jié)合,從而準(zhǔn)確地檢測出突變的存在。這有助于對疾病進行早期診斷和治療方案的制定。LNA探針還可以用于基因定位和疾病診斷。通過與染色體雜交,LNA探針可以準(zhǔn)確地檢測和定位特定基因或染色體片段。這有助于確定基因的位置和功能,同時也有助于疾病的診斷和治療。

提高 qPCR 探針的熱穩(wěn)定性。摻入LNA核苷酸后,由于LNA在錯配位點形成Watson-Crick堿基對的傾向更強烈,因此qPCR探針通過單核苷酸多態(tài)性(SNP)區(qū)分等位基因的能力會大大增強。熱變性研究表明,當(dāng)LNA 摻入在寡核苷酸的特定位置時,完mei匹配和錯配之間的 Tm 值存在顯著差異。因此,在 SNP 測定中,與天然狀態(tài)DNA探針相比,LNA qPCR探針雜交具有更強的不穩(wěn)定性,因此能夠更好地區(qū)分出錯配。

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由于可以使用LNA調(diào)整qPCR探針的Tm值,因此可以獲得具有不同GC 含量的幾個短序列的標(biāo)準(zhǔn)化Tm值。例如,富含AT的天然狀態(tài)DNA qPCR探針通常需要超過30個堿基長(有時需要超過 40個)以滿足擴增子設(shè)計指南,但仍有可能表現(xiàn)不佳。使用LNA qPCR探針,通過選擇性定 位LNA核苷酸,有助于產(chǎn)生最佳的、具有高度特異性的短探針。較窄的Tm值范圍對于微陣列和多重PCR應(yīng)用特別有益,特別是當(dāng)探針必須在相同條件下與許多不同靶標(biāo)的同時結(jié)合時。



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