TUNEL檢測(cè)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡(程序性細(xì)胞死亡)的方法。細(xì)胞凋亡是一種重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,它在多種生理和病理情況下發(fā)揮作用,包括發(fā)育、組織修復(fù)和免疫應(yīng)答等。那么你知道Tunel檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟與注意事項(xiàng)嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
一、Tunel檢測(cè)的操作步驟
1. 脫蠟和組織復(fù)性
將組織在二甲苯中浸泡兩次,每次10-20分鐘。在100%乙醇中洗滌兩次,每次5分鐘。然后依次在95%,70%和50%乙醇中洗滌3分鐘。
2. PBS洗滌和蛋白酶處理
用200-500 µL PBS洗滌樣品兩次,每次5分鐘。排除組織中多余的PBS,并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分鐘。
3. TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液/反應(yīng)混合物孵育
配制TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液。向每個(gè)樣品中加入50 µL反應(yīng)混合物,并在濕盒中避光下37℃孵育2小時(shí)。
4. PBS洗滌和DAPI復(fù)染
在PBS中將樣品洗滌3次,每次5分鐘。通過(guò)在1×DAPI中孵育10分鐘對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)染。
5. 觀察和拍照
將樣品在PBS中洗滌3次,每次5分鐘。然后加入水性封固劑或防淬滅溶液,封住蓋玻片。最后使用熒光顯微鏡觀察,并進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察,紅色通道(Ex/Em=555 nm/565 nm)。
二、注意事項(xiàng)
1. 設(shè)立陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照:
陽(yáng)性組:用DNase酶處理,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使3'-OH末端暴露。每次實(shí)驗(yàn)只需做一個(gè)陽(yáng)性組。
陰性組:不加TdT酶,其余操作和實(shí)驗(yàn)組相同。
實(shí)驗(yàn)組:除了陽(yáng)性組和陰性組,所有樣本均屬于實(shí)驗(yàn)組。
2. 選擇固定液:
建議使用4%多聚甲醛(PBS)進(jìn)行固定。不建議使用乙醇和甲醇作為固定液。不要選用含有甲醇的甲醛替代品,因?yàn)檫@會(huì)降低標(biāo)記效率,使熒光觀察困難。
3. 貼壁細(xì)胞處理:
貼壁細(xì)胞在加藥誘導(dǎo)凋亡后,細(xì)胞狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變,形態(tài)會(huì)皺縮邊緣,貼壁粘附力降低。在對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)染色時(shí),需要小心操作,避免吹打造成細(xì)胞脫落。特別是在多次洗滌細(xì)胞時(shí),操作要小心輕柔。
4. 避光操作和孵育:
熒光基團(tuán)長(zhǎng)期暴露在普通光照下,會(huì)發(fā)生嚴(yán)重淬滅。
在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)盡量避光操作和孵育,以保證熒光觀察效果。
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