轉(zhuǎn)染是生物學(xué)實(shí)驗中常用的實(shí)驗技術(shù),那么你知道DNA轉(zhuǎn)染有何注意事項嗎?讓我們一起來看看吧!
一、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染注意事項
1. 啟動子的選擇
啟動子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然無甚影響,但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。
2. 質(zhì)粒的大小和質(zhì)量
線性化還是超螺旋會影響轉(zhuǎn)染結(jié)果:超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性DNA高得多,特別是瞬時轉(zhuǎn)染。而線性化DNA轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒太大了轉(zhuǎn)染會困難一些。畢竟,相對致密、較小的外源異物被細(xì)胞內(nèi)吞的幾率要大一些。如果你的質(zhì)粒正好比較大,又沒有經(jīng)驗,選擇特別注明可以轉(zhuǎn)大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑成功幾率會高一些。有的轉(zhuǎn)染試劑還會提供一些促進(jìn)DNA凝聚的成分,使得DNA形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物時更致密一些,更容易轉(zhuǎn)染一些。純化質(zhì)粒的質(zhì)量也會影響轉(zhuǎn)染效率,一定要選擇高質(zhì)量的質(zhì)粒。
3. 質(zhì)粒DNA的濃度和量
既然質(zhì)粒純化已經(jīng)不成問題,初學(xué)者通常都不會在乎甚至愿意多加點(diǎn)DNA,但是要注意的是,DNA量過少固然轉(zhuǎn)染效率不高,DNA量過多同樣會降低轉(zhuǎn)染效率。所以預(yù)實(shí)驗需要按照說明書的要求,按一定比例混合適量的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。有的轉(zhuǎn)染試劑要求DNA的量多些,有的轉(zhuǎn)染試劑效率高只要很少DNA。
4. 轉(zhuǎn)染試劑的選擇
在確定了質(zhì)粒的質(zhì)量之后,就要考慮轉(zhuǎn)染試劑的選擇了。目前大多數(shù)用的是脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑,但這類試劑的毒性較大,轉(zhuǎn)染效率低,最好選擇非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑,如Entranster試劑。
二、細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染注意事項
1. 優(yōu)化條件
質(zhì)粒不同,所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不同及定量的準(zhǔn)確性等因素會導(dǎo)致在一些情況下所做的轉(zhuǎn)染不在該優(yōu)化條件內(nèi)。這種情況下需要對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的配比進(jìn)行優(yōu)化。另外,可選用更合適的轉(zhuǎn)染試劑,如Entranster試劑。
2. 抑制劑
不要在用于制備DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素,EDTA,檸檬酸鹽,磷酸鹽,RPMI,硫酸軟骨素,透明質(zhì)酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。
3. 細(xì)胞狀態(tài)及融合度
長勢旺盛的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果更佳,細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時融合度至少70%以上。
4. DNA純度及數(shù)量
確保質(zhì)粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。DNA量不能太高,單獨(dú)DNA也會對細(xì)胞生長有一個基礎(chǔ)的影響。
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