材料與儀器
磷酸鹽緩沖溶液 硫氰酸胍溶液 CsCl TES 緩沖液 乙酸鈉緩沖液 無水乙醇 經(jīng) DEFC 處理的水。
離心機 注射器及20W針頭
步驟
一 材料與設(shè)備
1) 磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)
2) 硫氰酸胍溶液：4mol/L 硫氰酸胍，0.lmmol/LTris-HClpH7.5，1%β-巰基乙醇
3)CsCl5.7mol/：L(DEPC 處理）
4)TES 緩沖液:0.1%SDS，10 mmol/LTris-ClpH7.4，lmmol/LEDTA
5)3 mmol/L 乙酸鈉緩沖液 (PH5.2，DEPC 處理）
6) 無水乙醇
7) 經(jīng) DEFC 處理的水
8) 離心機
9)6 ml 注射器及 20W 針頭
二 操作方法
1. 單層培養(yǎng)細胞
1) 室溫下用 PBS 洗滌細胞，每平皿 5 ml 洗滌 2 次。
2) 在不超過 105 個細胞中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液，使之遍布整個平皿。用橡膠細胞刮于擦刮平皿，回收黏稠的細胞裂解液，用裝有 20-G 針頭的注射器往返抽吸裂解物，舍并在一起
2. 懸浮培養(yǎng)細胞
1) 離心回收≤l08 個細胞，用相當于 1/2 原有體積的 PBS 重懸之，并再次離心回收細胞。
2) 往離心管中加人 3.5 ml 硫氰酸胍溶液。
3) 用裝有 20-G 針頭的 6 ml 注射器將黏稠的細胞裂解液往返抽吸 4 次，并將其移至一個干凈的試管中。本步驟的重要性在于可對染色體 DNA 進行剪切，以降低溶液的黏度，
4) 在經(jīng)硅化井高壓過的 13 mmX51 mm 的超速離心管中，加人 1.5 ml 5.7mol/LCsCl 并在 CsCl 層加人 3.5 ml 細胞裂解液，界面應(yīng)保持清晰。1)?4) 步的操作均在室溫進行。
5) 于 18℃，150000g 離心 12?20 h(緩慢加速和減速）
6) 用巴斯德吸管的管尖在液面上吸取上清，管子隨液面的下降而下降。當吸至僅剩約 100 ul 時，小心倒置管子, 倒出剩余液體在界面處應(yīng)有一白色的 DNA 帶，必須仔細地wan全移去此帶，因為它含有染色體 DNA。
7) 晾于沉淀約 5?lOmin，然后以 360ul TES 溶液重溶沉淀，反復(fù)用吸管上下抽吸，如此在室溫逬行 5?l0 min，轉(zhuǎn)移溶液于另一干凈的微量離心管。
8) 加人 40u 13 mol/L pH5.2 的乙酸鈉緩沖液和 1 ml 無水乙醇，在干冰/乙醇中沉淀 30mim，離心 10?15 min, 用 360 ul 水重溶沉淀并重復(fù)沉淀過程。
9) 沉淀晾干 l0 min, 溶解于 20ul 水中，取 10ul 稀釋至 lml，測 A260 和 A280. 最后，以水溶液或乙醇沉淀的形式在一 70℃ 儲存 RNA。
注意事項
1) 要用足夠的時間去重溶沉淀，否則 RNA 的產(chǎn)量會有顯著下降。
2) 小 RNA 在 CsCl 中離心時不能有效地沉淀，因此不能用此方法制備 5SRNA 和 tRNA 等分子。
3) 乙醇可以洗去沉淀中的氯化銫. 使沉淀易于溶解
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