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手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品名稱：手足口EV71/CA16/EV三通道核酸檢測(cè)試劑盒

英文名稱：Detection Kit for Enterovirus 71/Coxsackievirus A16/Enterovirus RNA (PCR-Fluorescence Probing)

手足口病 ( hand, foot and mouth disease,HFMD)在近年兒童中常見流行 ,由腸道病毒感染引起 ,主要表現(xiàn)口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹 ,主要病原為柯薩奇病毒 A16 型(CA16)和腸道病毒 71 型(EV71),二者所致的手足口病臨床難以區(qū)別。其中,EV71 不僅引起手足口病 ,而且可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥 ,如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等。實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道病毒的快速檢測(cè)有利于疫情監(jiān)測(cè)以及制定有效的預(yù)防控制措施。本試劑盒適用于糞便、咽/拭子、肛拭子樣本中腸道病毒的檢測(cè)，并可區(qū)分是否為腸道病毒 71 型或柯薩奇病毒A16 型。檢測(cè)結(jié)果僅供研究，不用于臨床診斷。

【試劑組成】

【適用儀器】ABI 7500、LightCycler480 等多通道熒光定量PCR 儀。

【注意事項(xiàng)】

1.樣本處理和核酸提?。颖咎幚韰^(qū)）

建議取 200μl 液態(tài)樣本進(jìn)行核酸提取?？刹捎帽竟旧a(chǎn)的核酸提取/試劑盒，請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。

本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控；EV71/CA16/EV 陽(yáng)性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR 檢測(cè)試劑的質(zhì)控。2.PCR 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

從試劑盒中取出EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液A、EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液B，室溫融化后振蕩混勻，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用。

2.1 EV71/CA16/EV 反應(yīng)體系配制

取適量PCR 反應(yīng)管，每管加入EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液A 17µl、EV71/CA16/EV PCR 反應(yīng)液B 3µl（也可根據(jù)PCR 反應(yīng)用量，計(jì)算各組分所需總量，混勻后分裝 20µl 于單個(gè)PCR 反應(yīng)管中）；

3. 加樣（樣本制備區(qū)）

于上述PCR 反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待測(cè)標(biāo)本核酸、EV71/CA16/EV 陽(yáng)性質(zhì)控品各5µl，蓋緊管蓋，8,000rpm 離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。

3.1  ABI Prism 7500 儀器設(shè)置（ABI 7500 儀器操作為例，ABI 7300 儀器參照此操作及儀器操作手冊(cè)）

3.1.1 打開“Setup"窗口，按樣本對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控（NTC）、陽(yáng)性質(zhì)控以及未知樣本（Unknown），并在“Sample Name"一欄中設(shè)置樣本名稱；探針檢測(cè)模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none； Reporter

Dye3：Texas Red，Quencher Dye3：none；Passive Reference：NONE.

3.1.1  打開instrument 窗口，設(shè)置循環(huán)條件如下： 50℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；

95℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；

94℃ 15 秒→55℃ 45 秒（收集熒光），40 個(gè)循環(huán)。設(shè)置完成后，保存文件，運(yùn)行程序。

3.2  LightCycler480 儀器設(shè)置

3.2.1  點(diǎn)擊軟件主界面的“New Experiment",進(jìn)入程序設(shè)定界面。

3.2.2  檢測(cè)模式設(shè)置：從Detection Format 的下拉框中選擇分析模式：Multi Color Hydrolysis Probe,“Customizes"模塊中選擇483-533、 523-568、 558-610 濾片組合，“Block Type"為儀器自動(dòng)檢測(cè)， “Plate ID"可手工輸入或掃描儀掃描，“Reaction Volume"設(shè)定為 25ul。

3.2.3  循環(huán)參數(shù)：定義PCR 程序中每個(gè)步驟（Program Name）及循環(huán)數(shù)(Cycles)和分析模式(Analysis Mode),利用“+"和“-"增加或刪除步驟，擴(kuò)增參數(shù)如下：

50℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；

95℃ 15 分鐘，1 個(gè)循環(huán)；

94℃ 15 秒 55℃ 45 秒，40 個(gè)循環(huán)；（此步采集熒光信號(hào)：“Analysis Mode"選擇“Quantification",“Acquisition Mode"選擇 “Single"）

40℃ 10 秒，1 個(gè)循環(huán)；

3.2.4  填樣品表：點(diǎn)擊“Sample Editor"模塊，進(jìn)入樣本信息編輯界面，在“Select Workflow"中選擇“Abs Quant",在“Sample Name" 列中定義樣本名稱,在“Sample Type"欄中選定樣品類型：陰性質(zhì)控品選NTC；未知樣品選Unknown。

3.2.5  運(yùn)行程序：點(diǎn)擊“Experiment"模塊，回到程序設(shè)定界面，點(diǎn)擊窗口右下方的“Start Run",彈出結(jié)果保存窗口，輸入文件名和路徑后進(jìn)入程序運(yùn)行界面。

4.  結(jié)果分析

4.1  反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。

4.2  分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的start 值、stop 值以及Threshold 的Value 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整， Start 值可以在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analysis 自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在 Report界面察看結(jié)果。

【質(zhì)量控制】

陰性質(zhì)控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路無明顯擴(kuò)增曲線；

陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路均有明顯擴(kuò)增曲線，且 Ct 值≤32； 以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。

【結(jié)果判斷】

1.  若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線在FAM、VIC、Texas Red 檢測(cè)通路均無擴(kuò)增曲線或Ct 值＞38，可判樣品為EV71、CA16、腸道病毒陰性；

2.  若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線在FAM 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為EV71 陽(yáng)性；

3.  若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線在VIC 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為CA16 陽(yáng)性；

4.  若檢測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線在Texas Red 檢測(cè)通道有擴(kuò)增曲線且Ct 值≤38，可判樣品為腸道病毒陽(yáng)性，此時(shí)FAM 或VIC 通道可能為陽(yáng)性，說明樣本為EV71 或CA16 陽(yáng)性；FAM 及VIC 通道也可能均為陰性，說明樣本為非EV71 非CA16 的其他型別腸道病毒。

【檢測(cè)方法的局限性】

樣本檢測(cè)結(jié)果和樣本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān)，其中任何失誤都將會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。如果樣本處理時(shí)沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

根據(jù)產(chǎn)品分析性能評(píng)估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為 1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（乙型腦炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、水痘病毒、腺病毒等）無交叉反應(yīng)。

【注意事項(xiàng)】

1. 本產(chǎn)品僅用于體外診斷；

2. 實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；

3. 為試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段提供生物安全柜，實(shí)驗(yàn)過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；

4. 試劑使用前要wan全解凍，8,000rpm 離心數(shù)秒后使用；

5. 標(biāo)本制備區(qū)所用過的吸頭請(qǐng)打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；

6. 實(shí)驗(yàn)完畢用 10%次氯酸或 75%酒精處理工作臺(tái)和移液器,然后用紫外線燈照射 20－30 分鐘；

7. 本試劑盒內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》。