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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | YLK10398P | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 科研實驗 | 保存條件 | 低溫運輸，-20℃保存 |
| 有效期 | 12個月 | 試劑盒說明 | 不同批號的試劑盒組分不可交互使用 |
人免疫缺陷病毒I型通用探針法RT-PCR試劑盒
產(chǎn)品名稱：人免疫缺陷病毒I型通用探針法RT-PCR試劑盒
英文名稱：Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1) RT-PCR Kit
人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus;abbr:HIV），即艾滋?。ˋIDS，獲得性免疫缺陷綜合征）病毒，是造成人類免疫系統(tǒng)缺陷的一種病毒。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首ci發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒，屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。目前全球流行的主要是 HIV-1。本產(chǎn) 品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測人免疫缺陷病毒 I 型通用的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)人免疫缺陷病毒I型RNA高度保守區(qū)設(shè)計，可以檢測人免疫缺陷病毒I型，不會跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量RT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
【試劑組成】
成分 | 包裝 |
探針法qRT-PCR緩沖液 | 500μL（藍蓋） |
探針法qRT-PCR酶混合液 | 100μL（紅蓋） |
熒光PCR專用模板稀釋液 | 1mL（綠蓋） |
人免疫缺陷病毒I型qRT-PCR 引物-探針混合液 | 150μL（棕色管） |
人免疫缺陷病毒I型RT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) | 50μL（黃蓋） |
使用手冊 | 1份 |
【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
【自備試劑】超純水，樣品RNA。
【注意事項】
一、稀釋標準曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，最好設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA/提取試劑盒兼容。
三、Probe qRT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | RT-PCR陰性對照 | 標準曲線樣品管 （1-6管） |
探針法qRT-PCR緩沖液 | 各10μL | 10μL | 各10μL |
探針法qRT-PCR酶混合液 | 各2μL | 2μL | 各2μL |
人免疫缺陷病毒I型RT-PCR 引物-探針混合液 | 各3μL | 3μL | 各3μL |
N+2個待測RNA樣本 | 各5μL | 不加 | 不加 |
超純水 | 不加 | 5μL | 不加 |
第6步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6號） | 不加 | 不加 | 各5μL（1號樣到1號管，2號樣到2號管…） |
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行RT-PCR：
過程 | 溫度 | 時間 |
逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30min |
預(yù)變性 | 94℃ | 5min |
RT-PCR反應(yīng) （45個循環(huán)） | 94℃ | 15sec |
60℃ | 1min（采集FAM通道的熒光信號） |
五、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于45。陽性對照必須有熒
光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于40。對待測樣品，如果其Ct大于或等于45則為陰性，如果小于或等于40則為陽性。如果在40-45之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于45則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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