安捷倫與科邁恩以及中國醫(yī)學科學院/協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所合作建立了一套完整地針對吐溫組成成分及其降解雜質(zhì)的精細表征，通過 UHPLC-6500 系列  Q-TOF MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，配合 PolymerStudio 聚合物分析軟件和專用數(shù)據(jù)庫，為制劑處方篩選和工藝優(yōu)化提供了有力工具。

圖 1. 吐溫及其降解雜質(zhì)的全面快速分析方案

吐溫降解初期的表現(xiàn)之一是亞類成分發(fā)生明顯變化，這些變化通常由于吐溫的水解產(chǎn)生，pH 值和酯酶的存在可能導致或加速吐溫的水解，主要表現(xiàn)為高酯化成分減少、酯化度降低、聚氧乙烯（POE）等未酯化成分含量增加且聚合度降低等。

實驗測試了吐溫 20 在制劑酸性環(huán)境下不同時間點的精細組成變化情況：從未酯化區(qū)域看，聚氧乙烯（POE）、聚氧乙烯異脫水山梨醇（PI）和聚氧乙烯脫水山梨醇（PS）的相對含量明顯增加，并且隨反應(yīng)時間延長而繼續(xù)升高，聚合度也有明顯降低（可能與聚氧乙烯水解有關(guān)）。從單酯含量看，辛酸單酯、癸酸單酯和月桂酸單酯的相對含量變化較小，肉豆蔻單酯、棕櫚單酯和油酸單酯的含量隨著反應(yīng)時間延長而明顯降低。雙酯及更高酯化度的化合物，隨著反應(yīng)時間延長，信號強度明顯減小甚至消失。

實驗同時考察了針對吐溫 80 的酯酶水解，觀察到了未酯化成分 POE、PI 和 PS 含量的增加，聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯（PSTO）和四油酸酯（PSEO）相對含量的明顯減少，并觀察到了（異）脫水山梨醇母核水解的產(chǎn)物。另外，除了精細組成的變化，吐溫水解直接表現(xiàn)為酯化度的降低，可以從 PolyPattern 軟件分析報告中直接讀出。本例中吐溫 80 經(jīng)過酯酶水解后，平均酯化度從 1.57 降至 0.71，而平均聚合度變化較小（從 21.38 微弱下降至 19.95），表明吐溫 80 的酯酶水解，以高酯化成分水解脫油酸為主，POE 鏈幾乎沒有水解。

吐溫 80 因其脂肪酸鏈存在不飽和雙鍵，在高溫、光照和金屬離子等影響下，可能發(fā)生一系列的氧化反應(yīng)，生成脂肪酸鏈變化的氧化產(chǎn)物。中國醫(yī)學科學院/協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所張金蘭老師課題組今年在 Anal. Chem. 上發(fā)表文章，詳細探討了吐溫 80 的 32 類 348 種氧化雜質(zhì)，優(yōu)化了 UHPLC-Q/TOF 結(jié)合 AIM（全離子 MS/MS，All Ions MS/MS）的表征技術(shù)，建立了保留時間-結(jié)構(gòu)特征鑒別模型，將高分辨質(zhì)譜信息、同位素分布、特征碎片離子及保留時間模型應(yīng)用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的鑒定。

上述研究工作，已經(jīng)同步寫入 PolymerStudio 軟件數(shù)據(jù)庫，用于吐溫 80 氧化產(chǎn)物的全面快速表征。下圖展示了某生物制劑中吐溫 80 氧化產(chǎn)物的相對含量分析，占比較高的氧化雜質(zhì)分別為聚氧乙烯脫水山梨醇單羥基油酸酯（PSMH）、聚氧乙烯異脫水山梨醇單羥基油酸酯（PIMH）和聚氧乙烯異脫水山梨醇雙羥基油酸酯（PIDH）。

圖 3. 某生物藥物中吐溫 80 各個亞類氧化雜質(zhì)的相對含量

在強降解等特殊實驗中，我們可能觀察到一些未知降解產(chǎn)物。這時可以利用 Q-TOF 的未知物鑒定能力，通過準確質(zhì)量和同位素信息，推測未知物的分子式，再結(jié)合二級質(zhì)譜特征碎片信息，推測未知物可能的結(jié)構(gòu)。下圖展示了在吐溫 80 的強降解實驗中，除了觀察到 POE 含量增加，聚合度降低，還出現(xiàn)了一系列 POE 的氧化產(chǎn)物，可以利用高分辨質(zhì)譜信息推測其分子式及可能的結(jié)構(gòu)。

圖 4. 吐溫 80 強降解實驗后 POE/PS/PI 的對比（右圖）及推測的 POE 氧化產(chǎn)物的質(zhì)譜信息（左圖）