一個典型的轉(zhuǎn)染過程涉及3-4個步驟：貨物包裝，跨膜轉(zhuǎn)運，細胞內(nèi)釋放，轉(zhuǎn)運進入細胞核。貨物的位置很大程度上影響它們是否能夠履行其預(yù)期的功能。例如，對于基因編輯，貨物必須定位在細胞核。因為對于長期穩(wěn)定的基因表達和基因編輯，貨物必須進入細胞核，并整合入基因組中，因此貨物的定位可視化將會非常有用。另外，對于siRNA介導(dǎo)的基因沉默或蛋白瞬時表達，藥物必須被遞送進入細胞質(zhì)中。熒光共聚焦顯微鏡是最直接的和普遍使用的評估貨物定位的方法。貨物通常用熒光染料染色，細胞核用DAPI染色，從而可視化熒光信號的共定位?？梢酝ㄟ^一些方法改善貨物在細胞核的定位，如使用細胞核定位信號和微管相關(guān)序列。

在轉(zhuǎn)染過程中，T細胞可能會經(jīng)歷不同程度的擾動，進而影響它們的關(guān)鍵生理特性，如基因表達。評估細胞擾動有以下幾種方式。鈣離子調(diào)節(jié)不同的細胞功能，作為第二信使參與多種細胞通路活動。細胞質(zhì)中的鈣離子水平通常維持在100*10^-9M，遠低于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體及細胞外環(huán)境的鈣離子水平（兩者分別在µM和mM范圍）。細胞內(nèi)熒光鈣水平的持續(xù)增加是細胞壓力的表現(xiàn)，可能會引起應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的信號通路。在轉(zhuǎn)染過程中，貨物通過機械穿孔或電流滲透的方式被引入細胞。這些過程在細胞膜上形成了孔道，鈣離子將會順著濃度梯度進入細胞質(zhì)中。細胞內(nèi)鈣濃度的水平的增加和高水平的持續(xù)時間是膜孔恢復(fù)穩(wěn)態(tài)所需時間的指標。一種定量評估鈣壓力的方法是使用熒光指示劑，如Fura-2，Indo-1和Fluo-4，并計算熒光扣除背景熒光之后的變化。另一種觀測細胞內(nèi)鈣水平的方法是通過使用基因編碼的熒光蛋白，如基因編碼的鈣指示劑（GCaMP）。相比化學(xué)指示劑，基因編碼的熒光蛋白不會造成細胞毒性，更適合長期觀測，但挑戰(zhàn)是質(zhì)粒構(gòu)造必須被優(yōu)化以確保蛋白可以穩(wěn)定表達。

穩(wěn)健的T細胞激活是細胞快速擴增的先決條件。T細胞早期激活標志物CD69可用于確定是否該生物特性被轉(zhuǎn)染影響?；罨?，T細胞分泌一系列的效應(yīng)細胞因子，如IL-2，TNF-α，IFN-γ（可以通過ELISA試驗檢測）。另一個更復(fù)雜的方法，多參數(shù)細胞因子染色不僅可以用于測定細胞因子的產(chǎn)生，還可以測定特定細胞亞型的功能標記分子。但該實驗方法的缺點是靈敏度低，需要大量的實驗方案優(yōu)化。

抗原特異性的T細胞可以增強療效和確保安全性。MHC多聚體技術(shù)可以用于測量修飾后的CAR受體/T細胞受體（TCR）和遞呈在MHC分子表面的特定腫瘤抗原之間傳導(dǎo)的免疫信號。這種單細胞試驗使用多種MHC-I或MHC-II分子亞基（二聚體到八聚體）分別驗證與表達CAR的CD8+或CD4+TCR之間的免疫作用。常用的四聚體技術(shù)是將四個生物素化肽-MHC糖蛋白鏈與鏈酶親和素主鏈連接在一起。

實體瘤對于CAR-T療法仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，一個挑戰(zhàn)是CAR-T細胞的腫瘤浸潤性差。T細胞能夠響應(yīng)生物分子遷移，而T細胞的遷移是一個非常重要的考量，因為T細胞對化學(xué)引誘劑的敏感性和遷移能力影響它們的效力，尤其是對實體瘤的效力。如果T細胞可以在實體瘤里遷移更快更均一，將可能實現(xiàn)更好的臨床效果。Transwell試驗是評價細胞遷移的常用方法，該方法使用一個填充了兩種介質(zhì)的小室，一種介質(zhì)是趨化因子如IP-10，另一種是結(jié)合了CXCR3受體的化學(xué)引誘劑，通過多種膜分開兩種介質(zhì)。T細胞培養(yǎng)在小室上層，一旦感知到趨化因子的化學(xué)梯度，將會遷移到小室下層。培養(yǎng)一段時間后，上層小室被移開，遷移到膜上的細胞數(shù)量可以在顯微鏡下通過血球計數(shù)確定。膜孔的大小需要謹慎選擇，避免細胞的非特異性轉(zhuǎn)移。如果使用了熒光標記的T細胞，可以通過熒光顯微鏡觀察隨時間變化的遷移行為。