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想做好化學試劑管理？這四點你都知道了嗎？2021/10/15
試劑種類繁多，而化學試劑無疑是試劑其中一種非常重要的試劑。它是進行化學研究、成分分析的相對標準物質，是科技進步的重要條件，可以說是化學工作者的眼睛?，F(xiàn)化學試劑己廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、科學、檢驗檢...
無菌技術：細胞培養(yǎng)的第一步2021/10/15
細胞培養(yǎng)是一整套的實驗操作體系，它涉及到實驗室設計、無菌操作技術、實驗安全、倫理、培養(yǎng)器皿、支持物選擇、質量控制等多方面的理論知識和實驗操作。對于剛接觸細胞培養(yǎng)或日常需要和細胞培養(yǎng)產(chǎn)品打交道的服務人員...
qPCR實驗結果分析基本步驟（三）2021/10/15
未經(jīng)處理的擴增曲線對數(shù)圖如下。以下情況，基線不需要調(diào)節(jié)：1、樣本擴增曲線剛好在基線最大值的地方開始。2、濃度最高的樣本，即擴增曲線最快進入指數(shù)期的，Ct值小于15（基數(shù)上限）。以下情況，基線需要調(diào)節(jié)：...
qPCR實驗結果分析基本步驟（二）2021/10/15
閾值，我們在操作軟件時上下拉動的橫線，是決定Ct值的因素之一。閾值是熒光信號相對于基線有顯著增強的點，大多數(shù)儀器會根據(jù)基線平均信號，自動計算熒光信號的閾值水平，并設置一個比平均值高10倍的閾值。也就是...
qPCR實驗結果分析基本步驟（一）2021/10/15
實時熒光定量PCR實驗會產(chǎn)生大量實驗數(shù)據(jù)，一般可以用PCR儀自帶的軟件進行收集、分析。但即使有了方便可靠的軟件，我們也需要對原始數(shù)據(jù)進行檢查、再分析，評估數(shù)據(jù)的質量和可靠性。這需要三個基本的步驟。第一...
qPCR實驗中探針和引物有什么區(qū)別？2021/10/14
可能會有小伙伴分不清楚探針和引物，覺得都是寡核苷酸沒什么區(qū)別。接下來告訴你，他們之間有什么區(qū)別：1、用途不同引物：用于pcr擴增探針：用于標記擴增產(chǎn)物2、本質不同引物：是一小段DNA或RNA，作用是在...
qPCR中的絕對定量是什么？2021/10/14
絕對定量目的是使用PCR測定目的基因在樣本中的數(shù)量，即拷貝數(shù)。在絕對定量中，想要得到目的基因的拷貝數(shù)，需要制作標準曲線圖。制作標準曲線圖需要將標準品稀釋至不同濃度，作為模板進行PCR。標準品是已知濃度...
qPCR中的相對定量是什么？2021/10/14
相對定量常用于測定兩個不同樣品中靶基因量的差異，例如使用實時RT-PCR法定量檢測mRNA水平的實驗。進行相對定量實驗分析兩個不同樣品的實驗數(shù)據(jù)時，需要對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，設置其中一個樣品的靶基因表...
什么是多重PCR？2021/10/14
多重PCR反應是指在單次PCR反應中同時擴增一種以上的靶基因。現(xiàn)有多種熒光染料可使用，使得運行多重實時熒光PCR成為可能。如能同時檢測薪冠、甲流、乙流的核酸檢測試劑盒，實驗原理就是多重PCR。常見的熒...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（六）2021/10/14
引物和探針的濃度也需要尋找*濃度，這通常憑借經(jīng)驗決定。為什么要尋找*濃度呢？因為像Taqman探針在反應過程中會被破壞，需要在起始濃度便保留足量的探針。這個濃度通常是在反應體系中達到250nmol/L...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（五）2021/10/12
想要提高探針的的效果，可以考慮在探針上采用LNA（鎖核酸）堿基或MGB（小溝結合劑）基團。這樣做的效果是：1、增強探針與靶序列的雜交強度。增強結合的特異性后，背景噪聲降低，從而提高整個實驗的靈敏度。2...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（四）2021/10/12
這期我們來學習設計TaqMan探針，應該考慮的因素有以下這些......1、TaqMan探針的最佳長度在20bp，不超過30bp，這樣才能實現(xiàn)熒光淬滅。有些情況下超過30bp也是可以的，需要將淬滅基團...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（三）2021/10/12
本期介紹設計引物，得到實時熒光PCR引物對，這種方法也可以用于普通PCR。1、長度應該在18～30bp，保證結合的特異性。2、熔解溫度（Tm值）應在55～60°C，兩條引物的Tm值應相差2～3°C。3...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（二）2021/10/12
如果你所研究的靶序列有前人建立過實時熒光定量PCR的方法，就可以在公共數(shù)據(jù)庫中查找，查看擴增效率、特異性、靈敏度等信息，省去從頭開始的時間。注意，使用前人建立的方法前，需要再次驗證這個方法的參數(shù)是不是...
實時熒光定量PCR的優(yōu)化（一）2021/10/12
如果是病毒定量和SNP基因分型的實時熒光定量PCR，我們需要盡可能高特異性；如果是病原體、mRNA檢測，我們需要高靈敏度。想要提高PCR擴增效率、特異性及靈敏度，我們可以通過一系列措施優(yōu)化實時熒光定量...
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