細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是一種常用的基因傳遞技術(shù)，其中慢病毒轉(zhuǎn)染作為一種有效的手段被廣泛采用。通過慢病毒載體，可將目的基因序列穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因中，實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)染方法不僅能夠在多種細(xì)胞系中高效地實(shí)現(xiàn)基因傳遞，還能夠?qū)崿F(xiàn)對特定基因的穩(wěn)定表達(dá)，為基因功能研究和細(xì)胞工程提供了重要工具。

早在1981年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)并研究了人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1），從而掀開了慢病毒作為載體的研究序幕。慢病毒（Lentivirus）載體是通過HIV-1進(jìn)行改造而得到的，其具備感染細(xì)胞的能力，包括分裂期和非分裂期細(xì)胞，同時(shí)在宿主體內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)長期表達(dá)且具備較高的安全性。這種載體能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因，具有廣泛的感染范圍等優(yōu)勢，因此在基因過表達(dá)、RNA干擾、miRNA研究等實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1、提前一天準(zhǔn)備細(xì)胞

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前一天，首先對293T細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理，并將其培養(yǎng)于10厘米培養(yǎng)皿中，以確保細(xì)胞能夠充分貼壁且密度達(dá)70%-80%。隨后，將細(xì)胞置于37攝氏度、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8至24小時(shí)，待細(xì)胞全部貼壁后即可開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

2、轉(zhuǎn)染

1）轉(zhuǎn)染前，需換液，使用10毫升血清培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基。

2）制備混合物包括包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑；

a. 將8µg 目的質(zhì)粒和16µg 病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 無血清Opti-DMEM，充分混合；

b. 將50µl轉(zhuǎn)染試劑溶于1ml Opti-DMEM中，充分混合，靜置5分鐘；

c. 將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加入質(zhì)粒稀釋液中，邊滴加邊輕輕混合，然后在室溫下靜置20分鐘，使DNA和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。取出培養(yǎng)皿，將配制好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕混合，標(biāo)記后放回培養(yǎng)箱中；

3）經(jīng)過6~8小時(shí)后，吸除培養(yǎng)基，用4ml PBS清洗一次，然后加入8ml 新鮮血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

3、收病毒

進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，每隔24小時(shí)將培養(yǎng)上清收集至50毫升離心管中，進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)記，并為細(xì)胞更換新鮮的血清培養(yǎng)基。在最后一次收集病毒液后，應(yīng)將接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)皿等物品浸泡于84消毒液中進(jìn)行消毒處理，然后安全丟棄。

4、包裝病毒

貼壁細(xì)胞：

1）慢病毒轉(zhuǎn)染前一天，將貼壁細(xì)胞鋪到24孔板中，確保每孔約有2×10^5個(gè)細(xì)胞。第二天，在37攝氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，并加入適量病毒懸液孵育。

2）對于polybrene毒性敏感的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)內(nèi)加入2毫升新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，然后用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基。

4）繼續(xù)傳代培養(yǎng)，如果慢病毒含有熒光蛋白，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通?？捎^察到明顯的熒光表達(dá)，72小時(shí)后表達(dá)更為明顯，如果慢病毒含有抗性基因并需要進(jìn)行藥物篩選，則可在轉(zhuǎn)染3-4天后開始添加藥物。

懸浮細(xì)胞：

1）將濃度為6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml懸浮細(xì)胞中，并加入適量病毒，充分混勻后在37攝氏度下孵育?；蛘哌M(jìn)行室溫離心，離心速度為150g，持續(xù)4小時(shí)（對于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，可選擇此步驟以提高轉(zhuǎn)染效率）。

2）對于對polybrene毒性敏感的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。根據(jù)細(xì)胞生長情況，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代或者更換培養(yǎng)基

二、注意事項(xiàng)

1）進(jìn)行慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意安全，穿實(shí)驗(yàn)服，戴口罩和手套。

2）在操作病毒時(shí)務(wù)必小心，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺，所有接觸過病毒的工具，如槍頭、離心管、培養(yǎng)皿以及培養(yǎng)液，請浸泡在84消毒液中過夜后，確保全部消毒后再進(jìn)行處理。

3）病毒操作時(shí)要使用生物安全柜，如果使用普通超凈工作臺，不能打開風(fēng)機(jī)。

4）如果加入Puromycin后觀察到細(xì)胞死亡較多，務(wù)必及時(shí)更換培養(yǎng)基，以防止死細(xì)胞釋放的有害物質(zhì)影響到具有抗性的細(xì)胞的生長。

5）需注意病毒液的儲(chǔ)存方式：若在短時(shí)間內(nèi)（3天內(nèi)）需要使用，可將病毒液存放于4攝氏度的冰箱中。然而，若無法在短期內(nèi)全部使用，建議將慢病毒液分裝后置于-80攝氏度的冰箱中保存。在分裝時(shí)應(yīng)根據(jù)每次使用的量進(jìn)行，將準(zhǔn)確的病毒液分裝至凍存管中，并做好日期和儲(chǔ)存量的標(biāo)記，封口膜密封以確保密封性。病毒液在-80攝氏度的冰箱中可保存約6個(gè)月。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)。