簡(jiǎn)介：

首先，如果你已經(jīng)設(shè)計(jì)了引物，PCR擴(kuò)增沒(méi)有條帶，請(qǐng)這樣做：

使用第一次的PCR產(chǎn)物作為模版（1~2ul即可），再進(jìn)行一次PCR。

那你要重新學(xué)習(xí)PCR擴(kuò)增了！這篇內(nèi)容，涵蓋了實(shí)驗(yàn)中可能遇到的PCR擴(kuò)增問(wèn)題和詳細(xì)的解決辦法，主要是如何培養(yǎng)問(wèn)題解決問(wèn)題的思考能力，你必須要知道！

PCR擴(kuò)增主要包括以下幾個(gè)組分：1）引物；2）酶；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注：現(xiàn)今大部分PCR酶試劑盒一般都是酶，dNTP和Buffer的預(yù)混液。

因此，需要從引物，酶，cDNA和DNA模版下手，進(jìn)行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要確定的是-cDNA。

每個(gè)基因在不同組織，不同時(shí)期中表達(dá)量是不同的。首先要確定你的基因在哪個(gè)組織，哪個(gè)時(shí)期表達(dá)最高，確認(rèn)之后就選這些組織和時(shí)期，否則很難做出來(lái)。

問(wèn)題：怎么查找目的基因在哪個(gè)組織和時(shí)期中表達(dá)高？

答：1）數(shù)據(jù)庫(kù)。例如NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

2）文章。查詢(xún)你目的基因的別人做過(guò)的文章，看看他們使用的什么。

3）新的基因，沒(méi)有數(shù)據(jù)庫(kù)記載，沒(méi)有報(bào)道，什么都不知道。使用幾種組織的混合的cDNA.

第二步：檢查你的酶

酶的品質(zhì)（主要是公司的工藝好不好），活性，保質(zhì)期，buffer的凍融程度都會(huì)很大程度影響PCR擴(kuò)增。因此，換一個(gè)酶是相對(duì)簡(jiǎn)單，必須試用的方法。

第三步：最需要實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)-引物設(shè)計(jì)

解決了酶和cDNA的問(wèn)題之后，需要進(jìn)行最復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)是靈活的，根據(jù)目的的不同而不同。qPCR引物設(shè)計(jì)因?yàn)榭梢栽谛蛄猩想S機(jī)選擇,因此可以使用引物設(shè)計(jì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在這里我們主要詳解基因克隆的引物設(shè)計(jì)，一般包括CDS的設(shè)計(jì)，基因區(qū)的設(shè)計(jì)，非編碼區(qū)的設(shè)計(jì)等，這些片段的引物設(shè)計(jì)一般都固定在一段序列上，不能隨意更改（GC含量，TM值都只能固定在一個(gè)相對(duì)范圍內(nèi)），因此需要一定的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，以下為詳細(xì)的解決方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,長(zhǎng)度不在18-25范圍內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)引物二聚體，設(shè)計(jì)的引物不能遵循引物設(shè)計(jì)的原則怎么辦？

答：不是所有的引物都必須遵循引物設(shè)計(jì)的原則，也不是所有遵循引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)原則的都可以擴(kuò)增出來(lái)。例如：GC含量為65%，長(zhǎng)度為28，如果實(shí)在設(shè)計(jì)不了符合原則的，可以以相對(duì)符合的設(shè)計(jì)方式進(jìn)行，不必全部符合。

2.設(shè)計(jì)了好幾組引物，都不能擴(kuò)增出來(lái)，怎么辦？

酶和cDNA都確定好之后，引物仍然擴(kuò)不出來(lái)?xiàng)l帶，對(duì)于不同的目的可以使用不同的方法。

①對(duì)于鑒定目的基因，只是想要確定這個(gè)基因的序列，可以這樣做：

在引物兩端加一段堿基（5‘的序列可以自己設(shè)計(jì)），改變引物的GC含量，TM值等。

②對(duì)于僅需要擴(kuò)增目的基因，不能在5’端添加堿基的情況，且使用F2/R2不能擴(kuò)增出條帶，可以這樣做：

先在CDS兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，先使用F1/R1進(jìn)行擴(kuò)增。然后再使用CDS引物F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增。

③對(duì)于表達(dá)載體，需要擴(kuò)增到載體上，可以這樣做：

1）先設(shè)計(jì)CDS區(qū)的引物F2/R2擴(kuò)增，再使用這個(gè)PCR產(chǎn)物作為模版，使用帶酶切位點(diǎn)（藍(lán)色為酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基序列）的引物F1/R1進(jìn)行擴(kuò)增。

2）改變所用的酶切位點(diǎn)。

3）換連接方法。如果使用T4連接，可以換成同源重組的方法。

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