簡(jiǎn)介：

  BMSCs即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中基質(zhì)細(xì)胞，是骨髓的支持結(jié)構(gòu)，并可作為滋養(yǎng)層支持骨髓中造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此也被稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。作為干細(xì)胞的一種，它同樣具有多向分化潛能，在一定的環(huán)境和細(xì)胞因子的作用下，可被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。其可被定義為具有多分化能力并且能自我更新復(fù)制的骨髓間質(zhì)細(xì)胞。其各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，使得它在臨床干細(xì)胞移植治療中顯示出極大的應(yīng)用場(chǎng)景。目前已廣泛使用在修復(fù)軟骨損傷、神經(jīng)細(xì)胞再生等領(lǐng)域。

材料與儀器:

• 燒杯、眼科剪、鑷子、紗布、巴氏滴管、1ml注射器、血清、α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺/核苷）、PBS、60mm培養(yǎng)皿、T25培養(yǎng)瓶、15ml試管、雙抗（青霉素、鏈霉素）D -hank’s液體

• 血清的保存方式：50ml離心管，分裝凍存-20攝氏度

• 胰蛋白酶的保存方式：25%的胰酶，用的時(shí)候-4℃，不用放-20℃凍存

• 高溫滅菌：高溫袋子、滅菌指示帶、燒杯、鑷子

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)配置溶液：

• 50mL的10%培養(yǎng)基：44.5ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（現(xiàn)配現(xiàn)用）+5ml FBS（10%）+ 0.5ml雙抗（1%）

• 10ml的2%FBS的培養(yǎng)基：9.7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.2ml FBS（2%）+0.1ml雙抗（1%)

• 成品雙抗（分裝，20℃下凍存，用1ml離心管分裝）

• 成品PBS：1×：50mlPBS=49.5mlPBS+0.5ml雙抗（1ml凍存液）

• 2×：50mlPBS+49.00mlPBS+1ml雙抗(凍存）

• 4個(gè)60mm培養(yǎng)基（分別裝PBS*2、10%FBS的培養(yǎng)基*2/1.5ml）

• 15ml的試管

(2)具體操作：

1、將大鼠脫頸處死，放于裝有酒精的燒杯中備用。給小鼠剝皮的過(guò)程可將小鼠置于盛有適量75%酒精的60mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行處理，個(gè)人建議每次單人操作不要超過(guò)2只小鼠，2只小鼠的細(xì)胞量已經(jīng)足夠，再多會(huì)延長(zhǎng)提取時(shí)間這對(duì)細(xì)胞活性是個(gè)重大打擊。

2、為避免細(xì)胞污染可將小鼠整個(gè)大腿分離后置于含有雙倍雙抗?jié)舛萈BS的60mm培養(yǎng)皿中暫存，待2只小鼠共四只大腿全部分離后在同一培養(yǎng)皿中用眼科剪及眼科鑷分離股骨和脛骨表面的肌肉，我自己分離時(shí)喜歡先用剪刀剪開髕韌帶之后順著這個(gè)剪開的縫隙將大腿分成股骨和脛骨兩段，然后將脛骨遠(yuǎn)端的幾根肌腱用眼科有齒鑷從骨頭上剝離，之后夾住肌肉將其從骨頭上撕下來(lái)，把那部分連著的腓骨也剪斷然后剝下來(lái)只留一根脛骨，將這段骨頭在另一個(gè)干凈的含有1X雙抗培養(yǎng)液的60mm培養(yǎng)皿中暫存。

3、待所有骨頭表面肌肉清理干凈后用剪刀剪開兩端骨骺，注意暴露骨髓腔后的骨頭不要再放回原來(lái)的培養(yǎng)皿，可再備另一個(gè)含有雙抗培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿用于暫時(shí)存放已經(jīng)剪開骨骺的骨頭（骨髓腔內(nèi)為無(wú)菌環(huán)境，剪開后放回原培養(yǎng)皿可能導(dǎo)致污染和細(xì)胞損失)。

4、沖洗干凈后將含有骨髓的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液收集到15ml離心管中用1ml移液槍反復(fù)吹打至無(wú)明顯細(xì)胞團(tuán)后離心去上清（這步也可以去除潛在的細(xì)菌，因?yàn)榧?xì)菌較輕，如果細(xì)胞間無(wú)菌等級(jí)高個(gè)人認(rèn)為可以跳過(guò)離心這步直接講細(xì)胞懸液吹勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)3h后換液）。

5、短時(shí)間內(nèi)換液可以有效去除雜細(xì)胞，但為了防止干細(xì)胞的丟失個(gè)人建議在第一次換液時(shí)將換下的培養(yǎng)液接種到另一個(gè)新的培養(yǎng)皿中補(bǔ)加少量培養(yǎng)基放入孵箱內(nèi)等待第一個(gè)8h后將2個(gè)培養(yǎng)皿同時(shí)換液。

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