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混合淋巴細胞增殖

時間:2023/1/11閱讀:924
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簡介

混合淋巴細胞增殖實驗也稱混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)或稱混合淋巴細胞反應(MLR),常用于器-官-移-植前的組織配型,以測定受體和供體主要組織相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。

材料與儀器

器材:細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管等、CO2 細胞培養(yǎng)箱、超凈臺。
試劑:
① 10%FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)基 ;
② 細胞 DCs 細胞、反應細胞、外周血單個核細胞。
③ 3 H-TdR 工作液


步驟

混合淋巴細胞增殖實驗的基本過程可分為如下幾步:
(一)刺激細胞(DCs)的制備
A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血,淋巴細胞分離液分離單個核細胞
B. 以 10% FCS-RPMI 1640 懸浮細胞置培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2 培養(yǎng) 2 小時,輕輕翻過培養(yǎng)瓶,棄掉培養(yǎng)上清,將非貼壁細胞棄掉,即得貼壁的單核細胞
C. 補加 10% FCS-RPMI 1640 同時加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF,500 IU/ml 的 IL-4,培養(yǎng)至第 7 天,收集懸浮細胞,即為 DCs
D. 刺激細胞經 25 μg/ml 的絲-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射線照射處理使刺激細胞失去增殖能力。
(二)反應細胞的制備
A 取健康人外周血制備單核細胞,PBS 洗 3 次后,37℃、5% CO2 貼壁 2 小時,收集懸浮細胞,作為反應細胞
B 以 RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸,調整細胞濃度至 1x106 個/ml。
(三)混合淋巴細胞反應
A 將刺激細胞調整濃度分別為 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 個/ml, 10%FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)于 96 孔培養(yǎng)板中,每濃度設立 3 孔,100μL/孔
B 將反應細胞濃度按 1x106 個/ml 每孔分別加入上述各孔中,100μl/孔
C 同時設立刺激細胞對照組(不同濃度刺激細胞 100μl+培養(yǎng)液 100μl)和反應細胞對照組(反應細胞 100μl+培養(yǎng)液 100μl)
D 37℃,5% CO2 培養(yǎng) 5 天后,3 H-TdR 摻入率檢測反應細胞的增殖水平。


注意事項

1. 實驗中注意無菌操作
2. 如作單向混合淋巴細胞實驗,則刺激細胞接受照射劑量要準確,使細胞暫時存活,但失去增殖的能力。


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