染色體制備

時(shí)間：2022/12/13閱讀：1220

原理

固定阻滯于分裂中期的細(xì)胞，在低滲液中膨脹，將細(xì)胞滴在載玻片上，染色，觀察 [ Rothfels and Siminovitch，1958；Rooney and Czepulkowski，1986 ] 。

材料與儀器

D-PBS 0.25%胰蛋白酶對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)細(xì)胞秋水仙酰胺
低滲溶液醋酸甲醇固定液 Giemsa染液 DPX或Permount封固劑冰
離心管巴斯德吸管載玻片蓋玻片載玻片盒低速離心機(jī) 渦流混懸器

步驟

1. 將 2× 104~ 5× 104 個(gè)細(xì)胞 /ml （4× 103~ 1× 104 個(gè)細(xì)胞 /cm2） 20 ml 在 75 cm2 的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2. 約 3.5 天后，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將 0.2 ml 的 1×10-5 mol/L 的秋水仙酰胺（用 D-PBSA 配制）加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)已有的培養(yǎng)基中，終濃度 1×10-7 mol/L 。

3. 4~6 小時(shí)后，輕輕去掉培養(yǎng)基，加 5 ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 10 min。

4. 在胰蛋白酶液中離心細(xì)胞，棄掉上清胰蛋白酶。

5. 以 5 ml 低滲溶液（0.04 mol/L KCl ; 0.025 mol/L 枸櫞酸鈉）重新混懸細(xì)胞，37℃ 下靜置 20 min 。

6. 加入等量新鮮配制的冰冷的醋酸甲醇（一份冰醋酸加三份無(wú)水甲醇或乙醇，新鮮配置并在冰上保存），不停地混合，然后以 100 g 速度離心 2 min。

7. 棄掉上清混合物，在渦流混懸器上震蕩細(xì)胞團(tuán)塊，再慢慢邊混勻邊加新制備的醋酸甲醇。

8. 細(xì)胞在冰上靜置 10 min。

9. 以 100 g 速度離心細(xì)胞 2 min 。

10. 棄掉上清醋酸甲醇，以 0.2 ml 的醋酸甲醇溶液，重新振蕩混懸細(xì)胞團(tuán)，直到細(xì)胞均勻分散。

11. 用吸管吸一滴細(xì)胞懸液到吸管尖部，從約 12 英寸（30 cm）處滴到?jīng)龅牟Ｆ希瑑A斜玻片，讓液滴流下并鋪開(kāi)。

12. 將玻片在燒杯沸水上迅速干燥，然后用相差顯微鏡觀察。如果細(xì)胞均勻鋪展而沒(méi)有相互接觸，則以同樣濃度的細(xì)胞制備更多片子。如果細(xì)胞成堆重疊出現(xiàn)，則稀釋懸液 2~4 倍之后，再制備一張滴液玻片。如果滿意，就制備更多片子，若不滿意，重復(fù)這一步驟進(jìn)一步稀釋。

13. 進(jìn)行 Giemsa 細(xì)胞染色：

(a)將玻片放在架子上，架子放在水池上。

(b)以數(shù)滴純 Giemsa 染液完-全覆蓋玻片，染色 2 min 。

(c)以約 10 倍體積的水淹沒(méi)玻片。

(d)再靜置 2 min。

(e)用流動(dòng)水沖掉稀釋過(guò)的染液。

(f) 最后用水逐張沖洗玻片去除染液沉淀。

(g)顯微鏡下觀察染色情況，如果滿意，則將載玻片徹-底干燥，用#00蓋玻片及 DPX 或 Pennoum 封片。

注意事項(xiàng)

必須倒掉染色液，因?yàn)檠趸娜旧焊≡鼤?huì)留在玻片上。即使在平皿中染色，染液也不能倒掉，而必須用水從下向上置換掉。

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