斑點和狹縫雜交

時間：2022/3/24閱讀：1003

材料與儀器

去離子甲酰胺甲醛（37%) 20XSSC NaOH 預(yù)雜交液
狹槽點樣器真空泵可燙封塑料袋或雜交管硝酸纖維 K 膜或尼龍膜 Whatman3MJV1 濾紙

步驟

一、材料與設(shè)備

1) 狹槽

2) 點樣器

3) 真空泵

4) 可燙封塑料袋或雜交管

5) 硝酸纖維 K 膜或尼龍膜

6)Whatman3MJV1 濾紙

7) 去離子甲酰胺

8) 甲醛（37%)

9)20XSSC

10)0.1mol/LNaOH

11) 預(yù)雜交液：50% 甲酰胺，5XSSC，2XDenhardt, 0.1%SDS，100ug/ml 鮭精 DNA。

二、操作方法

(-）樣品處理

將 l0ulRNA10ug，（RNA 可多至 50ug) 水溶液與下述溶液混合：

甲酰胺                                                  20ul

甲醛（37%)                                                     7ul

20XSSC                                                          2ul

于 60℃ 溫育 15 min 使其變性，冰浴冷卻樣品。

(二）點樣

用 0.lmol/LNaOH 清洗點樣器，再用 DEPC 水充分沖洗。將一張經(jīng) 20XSSC 浸潤的 Whatman3 MM 濾紙鋪在點樣器上，上面鋪張經(jīng) 20XSSC 浸潤 30 min 的硝酸纖維素膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。用 10XSSC 清洗各樣孔。在每一 RNA 樣品中加 2 倍體積的 20XSSC，混合后加樣。于外圍幾個孔中加染料定位，緩慢抽吸，毎孔用 lml10XSSC 淸洗 2 次。繼續(xù)抽吸 5 min，吸干濾膜。

(三) 固定

取出濾膜，室溫晾干后，夾在 2 張 Whatman3 MM 濾紙中間，80℃ 干烤 2 h 以固定RNA

(四）預(yù)雜交

濾膜烘干后放入可燙封塑料袋 (或雜交管）中，加入 20?30 ml 預(yù)雜交液，密封塑料袋后在 42°C 預(yù)雜交 3 h

(五）探針制備及標記

參見前面相關(guān)章節(jié)。

(六）雜交

將已標記的探針煮沸變性 l0 min，取出后立即置冰浴 10 min(單鏈探針不需要變性），將變性探針加入預(yù)雜交液中，密封雜交塑料袋后在 42℃ 雜交過夜。

(七）洗膜

雜交結(jié)束后，分別用下列洗液洗膜：

1)2XSSC，0.5%SDS，室溫洗膜 5 min。

2)1XSSC,0.1%SDS，42°C 洗膜 30rnin。

0.1XSSC，0.5%SDS，56℃ 洗膜 30 min。

(八）檢測

用 X 射線片進行放射性自顯影，附加增感屏，一 70°C 曝光 7?10 天。

注意事項

1) 使用快速制備法獲得的細胞總 RNA 有可能污染基因組 DNA, 因此難以用分光光度計來精確測定 RNA 含量。此外還必須防止上樣矯作物的出現(xiàn)。對半定最分析來說，每一樣品須做兩次狹縫印跡，一張膜與所要檢測的 RNA 探針雜交，另一張則與另-種RNA 探針雜交，這種在各個樣品中的表達都應(yīng)一樣，或者也可以對一個樣品制作-次印跡，但同一張膜必須進行兩次重復(fù)雜交。

2)RNA 樣品在點樣時要稀釋 8 倍，因此樣品的濃度至少為 10mg/mL

3) 狹縫雜交很容易出現(xiàn)假陽性性信號。這可通過以下手段盡可能的避免：①用 Northern 印跡方法嚴格鑒定探針的特異性；②在所用測試中均需要有適當?shù)年幮詫φ?；③須非常細心地制備所用探針、溶液、RNA 等以避免污染。

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