備擇方案 3 長(zhǎng)期細(xì)胞標(biāo)記

時(shí)間：2022/3/10閱讀：928

原理

長(zhǎng)期標(biāo)記意味著對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 6～32 h 持續(xù)的代謝標(biāo)記。該方法特別適用于研究合成速度相對(duì)較慢的蛋白質(zhì)或研究成熟的標(biāo)記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標(biāo)記是長(zhǎng)期標(biāo)記的一種形式，在此過程細(xì)胞和放射性標(biāo)記的氨基酸一起孵育直至放射性標(biāo)記蛋白的合成和降解速率相當(dāng)。如果蛋白質(zhì)復(fù)合體中的亞基的初級(jí)結(jié)構(gòu)已知，該方法可以對(duì)這些亞單位進(jìn)行化學(xué)計(jì)量。所加入的未標(biāo)記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標(biāo)記的時(shí)間和細(xì)胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有 5％～20％正常的非標(biāo)記甲硫氨酸含量。

材料與儀器

細(xì)胞懸液／貼壁細(xì)胞 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基
75 cm2 組織培養(yǎng)瓶

步驟

1. 在預(yù)熱的 37℃ 長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。

2.1 對(duì)于懸浮細(xì)胞：用預(yù)熱的長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基準(zhǔn)備并洗細(xì)胞一次（見基本方案步驟 2）。

在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重懸 0.5 ×107～2 ×107 細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中。

2.2 對(duì)貼壁細(xì)胞： 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng) 0.5 ×107 ～2 ×107 的貼壁細(xì)胞（80% ～90%融合），在 CO2 培養(yǎng)箱中。用預(yù)熱的長(zhǎng)期標(biāo)記培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次（見備擇方案 1 步驟 3）。每個(gè) 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液。

3. 擰緊蓋子以防 [35S] 標(biāo)記的化合物揮發(fā)。在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 16 h。

4. 洗細(xì)胞并測(cè)定摻入量（見基本方案步驟 5～7；或備擇方案 1 步驟 6～8）

注意事項(xiàng)

常見問題

同實(shí)驗(yàn)其他方法

氨基酸代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~

備擇方案 1 對(duì)貼壁細(xì)胞

1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞，取決于細(xì)胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1

備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細(xì)胞

1. 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和每個(gè)樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記

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