cDNA 3'末端的快速擴(kuò)增（3’-RACE)

時(shí)間：2021/12/21閱讀：1219

原理

在用 oligo (dT) 引物構(gòu)建的 cDNA 文庫中，偶而發(fā)生部分 cDNA 克隆缺失了與靶 mRNA 3' 末端互補(bǔ)的序列。這部分序列到底是在 cDNA 合成過程中還是在分子克隆中怎樣缺失和在哪個(gè)環(huán)節(jié)中缺失的尚不清楚。第一鏈 cDNA 的隨機(jī)斷裂，在合成第二鏈 cDNA 過程中 DNA 聚合酶不能抵達(dá)模板鏈的末端，引導(dǎo)序列內(nèi)部的 poly (A) 序列或在分子克隆過程中 poly (dA:dT) 序列附近的 3' 序列的缺失等都是可能造成 3' 末端序列缺失的原因。在用隨機(jī)六核苷酸引物構(gòu)建的 cDNA 基因文庫中，也存在部分的 cDNA 克隆缺失了 3' 末端序列，這是因?yàn)檫@種隨機(jī)引物能與靶 mRNA 的許多位點(diǎn)復(fù)性結(jié)合所致。

材料與儀器

反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶接頭引物基因特異性反義寡核苷酸引物總 RNA
擴(kuò)增緩沖液氯仿 dNTP 貯存液胎盤 RNase 抑制劑 TE
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭微量離心管正向排液式移液器 PCR 儀水浴箱

步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴(kuò)增緩沖液

氯仿

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)

胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/μl）

TE ( pH 7.6)

2. 酶與緩沖液

反轉(zhuǎn)錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶）

5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液

熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

接頭引物（10 μmol/L, 5' GACTCGAGTCGACATCG3' ) 溶于水中（10 pmol/μl）

（接頭引物可以與基因特異性正向引物聯(lián)合在一起用于擴(kuò)增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴(kuò)增后，PCR 目的產(chǎn)物可能僅占總 DNA 產(chǎn)物的 1%，也可能多至占總 DNA 產(chǎn)物的 100%。如果必要，可用第一輪 PCR 產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二輪嵌套式 PCR，改善目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個(gè)基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴(kuò)增后，幾乎所有的擴(kuò)增產(chǎn)物在 EB 染色下呈現(xiàn)了靶 mRNA 的 5' 區(qū)域序列相一致的條帶。

RT-PCR 的引物用自動(dòng) DNA 合成儀合成，用于標(biāo)準(zhǔn) RT-PCR的引物一般不需要進(jìn)一步純化。然而，如果寡核苷酸引物經(jīng)商品化的樹脂進(jìn)行柱層析純化（如 NENLife- Science 公司產(chǎn)品 NENSORB)或者經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的引物用于擴(kuò)增低豐度的 mRNA 時(shí)常常會(huì)更有效。）

（dT)17-接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)

基因特異性反義寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。

（基因特異性反義寡核苷酸引物應(yīng)該與靶 mRNA 的已知序列互補(bǔ)，其長度在 20~ 30 bp，內(nèi)含的 4 種堿基數(shù)量基本相等，G 與 C堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發(fā)形成穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向。）

總 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)+ RNA（10 μg/ml）溶于水中

（總 RNA一般用離液劑（chaotropic agents) 從細(xì)胞中抽提的，選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過 RT-PCR 克隆靶基因。對(duì)于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進(jìn)行 RT-PCR。運(yùn)用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養(yǎng)細(xì)胞中制備。）

5. 特殊設(shè)備

自動(dòng)微量移液器的屏蔽型槍頭

微量離心管（0.5 ml，薄壁擴(kuò)增反應(yīng)專用離心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 儀

水浴箱預(yù)設(shè)水溫在 75℃

二、方法

反轉(zhuǎn)錄

在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，首先要確定 3'-RACE 是否成功。如果反轉(zhuǎn)錄步驟是有效的，那么分離到含有靶 mRNA 的 3' 末端序列的克隆的幾率是高的。另一方面，如果反轉(zhuǎn)錄步驟是無效的，那么本方案的后續(xù)步驟是無法彌補(bǔ)的。因此，對(duì)于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件是值得花時(shí)間優(yōu)化的，如最佳的引物與模板比例，改變反應(yīng)體系 Mg2+ 濃度，尋找最適的 Mg2+ 濃度。

1. 轉(zhuǎn)染 1 pg 至 100 ng 的 poly （A）+ RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調(diào)整體積至 10 μl。將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min，將離心管迅速插入冰中冷卻。

2. 向含有這種變性的 RNA 樣品的離心管內(nèi)依次加入如下試劑：

5X 反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液                      10 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液               1.5 μl

10 μmol/L (dT)17-接頭引物（80 pmol） 8 μl

約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑          1 μl

100~200 單位/μl 反轉(zhuǎn)錄酶                    1 μl

H2O 補(bǔ)足至                                         50 μl

反應(yīng)管溫育在 37℃ 反應(yīng) 60 min。設(shè)置 3 支陰性對(duì)照管。在一支對(duì)照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應(yīng)所需的所有試劑，但不加模板 RNA；第二支對(duì)照管加入除了反轉(zhuǎn)錄酶外的所有試劑；第三支對(duì)照管中加入除引物外的所有試劑。這些對(duì)照管進(jìn)行所有的后續(xù)步驟。設(shè)置這些對(duì)照管能保證 cDNA 產(chǎn)物的不是由于污染或由 RNA 的自身引導(dǎo)所致。

3. 用 TE ( pH 7.6 ) 將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物（cDNA ) 稀釋至終體積為 1 ml。

擴(kuò)增

4. 按以下次序，將各成分加入到一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴(kuò)增管或滅菌微量滴定板的孔內(nèi)，建立 PCR 系列反應(yīng)管：

已稀釋 cDNA                                                             0~20 μl

10X 擴(kuò)增緩沖液                                                  5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                                      5 μl

10 μmol/L (dT)17-接頭引物（16 pmol）                        1.6 μl

10 μmol/L 接頭引物（32 pmol）                                  3.2 μl

10 μmol/L 基因特異性正義寡聚核苷酸引物（32 pmol） 3.2 μl

1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶     1 μl

H2O 補(bǔ)足至                                                                50 μl

如果實(shí)驗(yàn)必要，可建立系列的擴(kuò)增試驗(yàn)管，用于篩選 cDNA 產(chǎn)生最大量的 3' 末端擴(kuò)增產(chǎn)物的試驗(yàn)管。對(duì)照管加入以上除了 cDNA 模板之外的所有試劑，以鑒別模板有無污染。

5. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個(gè)加熱與冷卻的循環(huán)過程中蒸發(fā)；如果應(yīng)用熱啟動(dòng) PCR 程序，在反應(yīng)混合液上層加一滴石蠟油；放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。擴(kuò)增核苷酸的典型程序有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下：

6. 抽取每種擴(kuò)增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴(kuò)增結(jié)果，用判斷擴(kuò)增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來觀察擴(kuò)增的量與片段大小。

7. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層，反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

8. 從擴(kuò)增的 DNA 產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶和 dNTP。

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