哺乳動物 DNA 的快速分離

時(shí)間：2021/12/17閱讀：986

原理

根據(jù)本方案制備的哺乳動物 DNA 約 20~50 kb，適于作 PCR 反應(yīng)的模板。DNA 產(chǎn)量在 0.5 到 3.0 μg/mg 組織之間變化，或者是 5~15 μg/300μl 全血。

材料與儀器

無 DNase 的 RNase 蛋白酶 K 哺乳動物組織或全血
細(xì)胞裂解緩沖液乙醇異丙醇醋酸鉀溶液紅細(xì)胞裂解緩沖液 TE
連有真空管的抽吸裝置微量離心研棒水浴

步驟

一、材料

1. 緩沖液及溶液

細(xì)胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，0.1%（m/V） SDS）

乙醇

異丙醇

醋酸鉀溶液（60 ml 的 5 mol/L 醋酸鉀，11.5 ml 冰醋酸，28.5 ml 水）

紅細(xì)胞裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

TE ( pH 7.6)

2. 酶及緩沖液

無 DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

3. 專用設(shè)備

連有真空管的抽吸裝置

微量離心研棒

預(yù)先調(diào)到 55℃ 或 65℃ 的水浴

4. 細(xì)胞和組織

哺乳動物組織或全血

二、方法

1. 準(zhǔn)備用于分離 DNA 的組織或全血

(1) 組織

① 切下 10~20 mg 組織。

② 用剃刀或解剖刀切碎組織或者將組織冷凍于液氮中，用在液氮中預(yù)冷的研缽研磨成粉。

(2) 血液

① 在兩個微量離心管中分別轉(zhuǎn)移 300 μl 全血樣品。每管中加入 900 μl 紅細(xì)胞裂解緩沖液，蓋上蓋子，顛倒混勻。溶液于室溫下放置 10 min, 中間顛倒混勻幾次。

② 室溫下用最大轉(zhuǎn)速離心 20 s。

③ 每管保留 20 μl 上清，棄去其他部分。

④ 用剩余的少量上清重懸白細(xì)胞沉淀。將兩管中的沉淀合成一管。

2. 將切碎的組織或者重懸的白細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到加有 600 μl 冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液的離心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下，混勻懸濁液。

3. (可選擇的）向裂解產(chǎn)物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因組 DNA 的產(chǎn)量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上，但不要超過 16 h。

4. 消化液降至室溫，然后加入 3 μl 4 mg/ml 的無 DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

5. 將樣品降至室溫。加入 200 μl 醋酸鉀溶液，劇烈振蕩 20s 使其充分混合。

6. 用最高轉(zhuǎn)速 4℃ 離心 3 min, 使蛋白/SDS 復(fù)合物沉淀出來。

7. 將上清轉(zhuǎn)移到加有 600 μl 異丙醇的新離心管中。充分混合，然后用最大轉(zhuǎn)速室溫下離心 1 min 收集 DNA 沉淀。

8. 吸去上清，加入 600 μl 70% 的乙醇。顛倒管子數(shù)次，用最大轉(zhuǎn)速室溫下離心 1 min。

9. 小心吸去上情，空氣中干燥 DNA 沉淀 15 min。

10. 將 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。

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