CAT活性的層析分析法

時(shí)間：2021/12/14閱讀：983

材料與儀器

DNA
PBS 乙酸乙酯氯仿甲醇 Tris·Cl
薄層層析缸濾紙離心管離心機(jī)

步驟

1. 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞，用PBS洗兩次，每次5 ml每培養(yǎng)皿加入1 ml TEN溶液。將細(xì)胞置于冰浴5 min。

2. 用橡膠細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來(lái)，將其轉(zhuǎn)入一只1.5 ml 的微量離心管中，置于冰浴5 min。

3. 在4℃以最大離心速度離心細(xì)狍1 min，細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 冰冷的0.25 mol/l 的pH7.5的Tris·Cl緩沖液中。

4. 在干冰/乙醇中凍結(jié)細(xì)胞5 min，移至37℃融解5 min。重復(fù)這種凍融過(guò)程兩次以上。

5. 在冰上冷卻細(xì)胞裂解液，然后，4℃以最大離心速度離心5 min。移出并保留上清（細(xì)胞提取物），置于- 20℃凍存。

6. 在下面混合液中分析20 μl 細(xì)胞提取液

2 μl 200 μCi/ml ［14C］氯霉素
20 μl 4 mmol/l 乙酰輔酶A
32.5 μl 1 mol/l Tris·Cl，pH7.5
75.5 μl H2O

7. 對(duì)于每組分析，在微量離心管中加130 μl 上述混含液和20 μl 提取液，輕輕混勻。 37℃溫育1 h。

8. 加1 ml 乙酸乙酯至反應(yīng)液中，在漩渦混合器上混勻。離心1 min，移出上層液相（乙酸乙酯）在Speedvac蒸發(fā)器中蒸干乙酸乙酯45 min。

9. 薄層層析缸的平衡：在缸中加入190 ml 氯仿，10 ml 甲醇，及一張與TLC薄層平板大小大致相等的Whatman 3MM 濾紙，靜置2 h。

10. 將毎個(gè)樣品重懸于30 μl 乙酸乙酯中，點(diǎn)樣，在TLC薄板邊緣之上約2 cm 處，每樣5 μl。

11. 在盛有200 ml 19：1氯仿/甲醇的平衡過(guò)的層析缸中展開(kāi)色譜，進(jìn)行2 h 或至溶劑的前沿接近薄板的頂部為止。取下TLC薄板，在空氣中晾干。用放射性墨水筆作上標(biāo)記后，用塑料薄膜包裹，置于感光片上進(jìn)行放射自顯影。

12. 切出各顯影點(diǎn)相應(yīng)的薄層塊放入閃爍液中計(jì)數(shù)，先測(cè)定出各單乙酰氯霉索的計(jì)數(shù)值所占的百分?jǐn)?shù)而計(jì)算提取物的活性，按下列公式計(jì)算的活性：

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