siRNA轉(zhuǎn)染和干擾效果不佳的問(wèn)題。
要保證RNA干擾的效果就必須保證siRNA能夠成功的轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中去，那有時(shí)候會(huì)轉(zhuǎn)染不進(jìn)去，原因可能有如下幾點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染siRNA濃度太低。FAM驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率時(shí)siRNA(FAM)的量的終濃度是50-150nM都可以，需要根據(jù)細(xì)胞進(jìn)行摸索。lipo2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。建議用24孔板摸索條件。siRNA所加的量及其濃度可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)自己調(diào)整，按照要求配成20uM的濃度，那1ul就是20pmol,在1ml細(xì)胞培養(yǎng)液中加1ul,那終濃度就是20nM,加2ul就是40nM，以此類推。24孔板摸濃度后，用6孔板時(shí)把轉(zhuǎn)染體系相應(yīng)放大即可。實(shí)驗(yàn)中需要注意細(xì)胞狀態(tài)要好，代數(shù)不要太大，細(xì)胞密度適中，50%左右（根據(jù)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)節(jié)），鋪板時(shí)要鋪均勻，添加轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要小心滴加。轉(zhuǎn)染時(shí)建議不要使用雙抗和血清，雙抗轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不好，血清會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。2、轉(zhuǎn)染試劑：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，通過(guò)這些資料可選擇較為適合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)染試劑?？赡芗?xì)胞對(duì)lipo2000不是太敏感，建議更換其他的轉(zhuǎn)染試劑，例如ZETA LIFE Advanced系列轉(zhuǎn)染試劑，采用第三代多肽小分子材料，轉(zhuǎn)染的效率非常高，尤其轉(zhuǎn)siRNA效果非常好。a、轉(zhuǎn)染效率跟細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞密度等有關(guān)，一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔儭Ｗ钸@適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說(shuō)同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。b、有的細(xì)胞不太好轉(zhuǎn)染，比如懸浮、干細(xì)胞、原代細(xì)胞等，可查找相關(guān)文獻(xiàn)，看別人做這種細(xì)胞時(shí)用的什么方式。如果細(xì)胞不好轉(zhuǎn)，就要考慮換一種方式進(jìn)行您的實(shí)驗(yàn)了，比如說(shuō)用病毒、電轉(zhuǎn)等。
下圖是轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的siRNA后的前列腺癌細(xì)胞所拍的圖片，轉(zhuǎn)染進(jìn)去的整個(gè)細(xì)胞是綠色的，可以清晰的看到細(xì)胞形態(tài)，沒(méi)有轉(zhuǎn)染進(jìn)去的就是綠色的小點(diǎn)兒。
如果通過(guò)上邊的問(wèn)題驗(yàn)證到siRNA的確是可以轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，但干擾效果又不理想的話那么可能的原因如下：
1、轉(zhuǎn)染效率問(wèn)題。如果少量siRNA進(jìn)入細(xì)胞，作用于基因后，有時(shí)候細(xì)胞會(huì)有補(bǔ)償機(jī)制，表達(dá)量反而升高。建議在實(shí)驗(yàn)前，先檢測(cè)一下轉(zhuǎn)染效率，觀察一下，轉(zhuǎn)染進(jìn)去的整個(gè)細(xì)胞是綠的，沒(méi)有轉(zhuǎn)染進(jìn)去的是一些綠色的小點(diǎn)粘附在細(xì)胞上，發(fā)的光是點(diǎn)狀的。建議多做幾個(gè)轉(zhuǎn)染梯度，找到最佳轉(zhuǎn)染條件。2、檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。建議轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)檢測(cè)RNA水平變化，48-72小時(shí)檢測(cè)蛋白水平變化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干擾是拋物線形的，多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)有利于siRNA干擾效果的測(cè)定。3、推薦RT-PCR的引物應(yīng)該設(shè)計(jì)在target位置的兩側(cè)，而不是同側(cè)。目前已經(jīng)知道的siRNA介導(dǎo)的基因knockdown機(jī)制是RSIC先介導(dǎo)靶mRNA的切割，切割導(dǎo)致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的時(shí)間點(diǎn)，因此，設(shè)計(jì)于同側(cè)的PCR引物可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果或knockdown效率的低估。4、RNA降解。建議-20保存，溶解后要最小量分裝，-20或者-80保存，3個(gè)月內(nèi)用完，避免反復(fù)凍融或者4度保存。干粉保存最長(zhǎng)最好不要超過(guò)6個(gè)月。
5、基因問(wèn)題。有的基因受細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，mRNA能敲除，但是蛋白水平敲除不下來(lái)的，如果這樣，建議換一種細(xì)胞看看。
6、干擾靶點(diǎn)不合適。需重新設(shè)計(jì)siRNA。
以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
安培生物科技有限公司介紹：
安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染、大規(guī)模生物生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑；inviCELL™Platelet lysate無(wú)動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn)，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù)；提供以植物生物為平臺(tái)基因序列全人源化、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性影響、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)，努力發(fā)展為基因治療、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。
