材料與儀器
Wistar大鼠
亞（石西）酸鈉 腐胺 轉(zhuǎn)鐵蛋白 胰島素 甲狀腺素 黃體酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗體
眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
步驟
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。
2. 接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。
3. 加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，37℃，50mL/L CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3 d 。
4. 3 d 后棄廢液，改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 每周換液2次。在獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量后，改用無(wú)血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液一次。
二、形態(tài)學(xué)觀察
每天在倒置顯微鏡，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。
三、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定
1. 將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次x5 min。
2. 冷丙酮固定10 min。
3. PBS沖洗(3 次x5 min)。
4. 30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。
5. PBS沖洗3 次x5 min。
6. 滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。
7. 滴加1:100 GC抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。
8. PBS沖洗3 次x5 min。
9. 滴加 生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃，20 min。
10. PBS沖洗3 次x5 min。
11. 滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。
12. DAB工作 液顯色，自來水終止反應(yīng)。
13. 脫水，透明，DPX封片保存。
四、結(jié)果
1. 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
組織塊24 h 開始貼壁，48～72 h 可見神經(jīng)組織邊緣游出少量細(xì)胞，主要為圓形或梭形(圖 1)。8～9 d 左右，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)孔。此時(shí)改用無(wú)血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行純化。培養(yǎng)過程中，部分細(xì)胞死亡。12 d 左右獲得的細(xì)胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約 6～10μm。細(xì)胞核較大，胞質(zhì)少(圖 2)。
2. 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色 GC 蛋白陽(yáng)性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀(圖 3)。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細(xì)胞較少，90%以上為陽(yáng)性細(xì)胞(圖 4)。
Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)
圖 1. 培養(yǎng)第 3 天，細(xì)胞自視神經(jīng)遷出 (10x10)
Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)
圖 2. 培養(yǎng)第 15 天，純化的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞(10x40)
Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)
圖 3. 培養(yǎng)第 7 天，少突膠質(zhì)細(xì)胞 GC 陽(yáng)性表達(dá) (10x20)
Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)
圖 4. 培養(yǎng)第 15 天，純化的少突膠質(zhì)細(xì)胞 GC 陽(yáng)性表達(dá)(蘇木素復(fù)染)(10x20)
