材料與儀器
SD大鼠
硼酸硼砂緩沖液 胰酶-EDTA 消化液 D-Hanks’
眼科剪 滴管 離心機 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
步驟
一、實驗步驟
1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)戊巴(匕匕)妥鈉麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚,依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜,無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks’平衡鹽液中。
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層,除去腦膜,剪碎組織成約1mm3 大小,加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min,中間搖晃一次。
3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM+10%FBS 的離心管內(nèi),用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次,靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟 2~3 次。
5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。
6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min,棄上清,管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM+20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。
7. 細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度按1.5x105/cm2 種入6 孔板內(nèi),放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量換液。以后每隔 3 天半量換液一次。