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當(dāng)前位置:深圳市安培生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>表達融合蛋白時,如何把兩個基因拼接起來?
A君:我要表達一個 ras 加 GFP 融合蛋白,怎么設(shè)計引物?
安培君:你的 GFP 標簽蛋白在載體里還是要你自己插進去?
A君:是我自己插進去。
安培君:你打算怎樣融合?
A君:是不是這樣?酶切 A 基因,酶切質(zhì)粒,把 A 先插入載體,篩選出克隆,然后酶切 B 基因,用不同的酶酶切質(zhì)粒,將 B 基因插入含 A 的載體。
安培君:No,何必這么復(fù)雜,SOE PCR 吧!
A君:什么是 SOE PCR?
SOE PCR 是一種通過寡聚合甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板進行 PCR 擴增,從而獲得目的 DNA 基因片段的方法。SOE PCR 可簡單地憑借互補引物,通過 PCR 迅速地將兩段 基因連接在一起,成為新的雜交基因片段。
若要將基因 A 和 B 連接在一起,假設(shè)引物 P1、P2 擴增基因片段 A,引物 P3、P4 擴增基因片段 B;P2、P3 為內(nèi)引物,P2 上含有 B 的序列,P3 上含有 A 片段的互補序列。單獨 PCR 后, P1、P2 將 A 的 3'端帶有 B 的 5'端的互補序列,P3、P4 將 B 的 5'端帶有 B 的 3'端的互補序列;將各自 PCR 產(chǎn)物混合作為模板,變性退火后,A 鏈和 B 鏈結(jié)合起來,延伸成新的雜交基因,可以將 A、B 連接起來。
下面以表達融合蛋白 S 和 A 為例,給大家介紹拼接基因 S 和基因 A 的方法,先在 NCBI 中 查找兩個基因的 mRNA 序列,然后利用 primer6.0 軟件,設(shè)計擴增基因 S 和 A 基因的引物, 并去除 S 的終止子和 A 基因的起始密碼。
關(guān)鍵問題來了,引物要怎么設(shè)計?SOE PCR 引物設(shè)計跟普通 PCR 引物有什么不同?
*SOE PCR 引物比較長,可長達 80bp,太短要增加反應(yīng)次數(shù),提高成本。(土豪可忽略)
*引物有重疊區(qū)域,引物間的 overlap region 以 25~30bp 為宜,盡量避免富含 AT 的序列。
*考慮引物的 TM 值,依照“50℃規(guī)則“可以設(shè)計出可行的重疊區(qū),但也必須全面考慮其他引物的 Tm 值,在 PCR 的前 5 個循環(huán)中,采用就低引物 Tm 值設(shè)計退火溫度是很好的解決辦法。
*引物長,更要避免自身二級結(jié)構(gòu)、引物二聚體形成等。 在 S 上游引物 5'端加入 EcoR V 限制性核酸內(nèi)切酶位點,在其下游引物 5'端則加入 BamH I 限制性核酸內(nèi)切酶位點、含 5 個氨基酸殘基的柔性肽基因序列(linker 序列) 以及基因 A 的部分 5'端序列,在 A 基因的上游引物 5 端加入 BamH I、含 5 個氨基酸殘基的柔性肽基因序列 (linker 序列)以及基因 S 的部分 3’端序列,在其下游則加入酶切位點 Not I 酶切位點。
S (P1): 5'-ATAGATATC GGAGAA CGG GAT ATG TTT AG-3'
S (P2)5'- ATA GGATCC ACC GCC ACC GAC ATTGCC AAC GTA TTT TAAG- 3'
A (P3): 5'-ATA GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCC GCT CAA GTA AT C AAC ACT-3'
A (P4): 5'-GCGGCCGC CGACAT CCTATC GACCTAAC-3'
劃線部分為酶切位點
接著以 S (P1)和 S (P2)為引物,含有 S 基因的 cDNA 為模板;以 A (P3)和 A (P4)為引物,含有 A 基因的 cDNA 為模板;進行 PCR,得到上述產(chǎn)物并鑒定后,將兩者混合作為模板,以 S (P1) 和 A (P4)為引物擴增融合基因 S-A。采用兩步法循環(huán)模式:第一步將兩種模板混合后,在不加引物的情況下循環(huán) 3 次;第二步加上引物后,在循環(huán) 28 次。
將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入載體進行后續(xù)的克隆。 引物的結(jié)構(gòu)組成看上去雖然復(fù)雜,但設(shè)計起來卻十分簡單,無非就是在普通引物設(shè)計的基礎(chǔ)上加上重疊區(qū)以及一些修飾:
*Gene S 5’端的修飾,gene A 3 ‘端的修飾,比如增加限制性酶切位點進行克隆和表達。
*Gene S 3’端的突變,gene A 5’端的突變,比如進行偏嗜密碼子的修改、起始密碼子的摻入。
*在 gene S 和 gene A 之間添加 DNA linker。
在應(yīng)用這一技術(shù)時,還有幾個要注意的問題:
*DNA 酶的質(zhì)量:應(yīng)避免使用 Taq 酶,因其在 PCR 產(chǎn)物 3 端添加一個突出的 A,從而造成移碼,翻譯蛋白時全部錯位,不好意思今天白忙活,去墻角哭會。因此,為了最大限度地避免堿基的錯配,一般采用具有 3‘-5‘外切酶活性的高保真酶,如 TLI DNA Polymerase (Promege)、 KOD DNA Polymerase(Toyobo)、Pyrobest DNA Polymerase (Takara)。比起普通酶,這些高保真酶是貴了點,但真的物有所值。
*模板的來源: 在構(gòu)建嵌合 ORF 時,如果選擇基因組 DNA 為模板的話,可能會 P 出非翻譯 區(qū),宜選擇 mRNA 作為原始模板。
*接頭序列(Linker):通過一段適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來, 使其在適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)表達成為一條單一的肽鏈, 使得融合蛋白中的兩種成分能分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、 更好的發(fā)揮生物學(xué)活性。Linker 序列就像安排一個人畜無害的小伙伴在性格比較暴躁的兩人之間,充當(dāng)和平使者,避免沖突。
*Mg2+是 DNA 聚合酶活性的依賴離子,Mg2+濃度過低會影響聚合酶活性,過高會造成非特異擴增。SOE-PCR 中:在保證產(chǎn)物擴增效率及特異性的前提下,盡可能降低 Mg2+的濃度, 這可最大限度地提高 DNA 聚合酶的保真性。
今天就分享到這,大家記得要好好消化一下!
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