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通俗易懂熒光定量PCR原理
一、熒光定量PCR原理
熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
以探針?lè)晒舛縋CR為例：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。開(kāi)始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準(zhǔn)確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽(yáng)性，使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動(dòng)化程度高和無(wú)污染的特點(diǎn)，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，這個(gè)期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性，在該期間，可設(shè)定一條熒光閾值線，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性。
Ct值最大的意義就是用來(lái)計(jì)算目的基因的表達(dá)量，此時(shí)就有兩個(gè)概念容易被提及，那就是絕對(duì)定量和相對(duì)定量，絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
Ct值誠(chéng)然可以被利用來(lái)計(jì)算這兩種定量結(jié)果，但是絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對(duì)定量的方法來(lái)計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。
二、熒光定量PCR中的對(duì)照
對(duì)照的目的是對(duì)檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控，因此我們按照檢測(cè)的流程對(duì)對(duì)照進(jìn)行梳理。
常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運(yùn)輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄（RNA病毒）-擴(kuò)增-結(jié)果讀取。
下面看看各個(gè)環(huán)節(jié)都可以使用哪些對(duì)照？
1.陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照
陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是指在相同的處理?xiàng)l件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進(jìn)行了提取和擴(kuò)增最終獲得了陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽(yáng)性對(duì)照強(qiáng)調(diào)處理過(guò)程與樣品一致，并且有明確的預(yù)期結(jié)果。
2.擴(kuò)增對(duì)照
我們通常說(shuō)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照指的是擴(kuò)增試劑盒中附帶的不需要提取的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，更準(zhǔn)確的定義應(yīng)該是擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照和擴(kuò)增陰性對(duì)照。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照含有陽(yáng)性擴(kuò)增模板，擴(kuò)增陰性對(duì)照應(yīng)含有陰性擴(kuò)增模板（基質(zhì)核酸）。擴(kuò)增對(duì)照只能監(jiān)控每次擴(kuò)增過(guò)程中的擴(kuò)增系統(tǒng)是否正常，不能監(jiān)控采樣、提取和每份樣品的操作過(guò)程。如果是檢測(cè)RNA樣品的檢測(cè)試劑盒，其擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照使用質(zhì)粒，便無(wú)法監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。
3.內(nèi)標(biāo)（Internal Control，IC）
內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴(kuò)增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點(diǎn)是與靶序列共同擴(kuò)增，而其他的對(duì)照都是獨(dú)立擴(kuò)增。
3.1 內(nèi)參基因
通常它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因?yàn)槠浔磉_(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nèi)參基因的優(yōu)點(diǎn)是與樣品中的靶基因經(jīng)歷*相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣，運(yùn)輸，核酸提取和擴(kuò)增的全部過(guò)程。缺點(diǎn)是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立。如果檢測(cè)的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能*失效。
3.2人工內(nèi)標(biāo)
添加一種不會(huì)干擾靶序列擴(kuò)增的人工合成的內(nèi)標(biāo)?，F(xiàn)在國(guó)外的診斷試劑盒大部分都會(huì)將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴(kuò)增，但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣，運(yùn)輸和核酸提取的過(guò)程。
還有另一種形式的內(nèi)標(biāo)，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴(kuò)增的過(guò)程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細(xì)菌病毒的釋放情況。
4.核酸提取對(duì)照
可以使用內(nèi)參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來(lái)監(jiān)控提取到擴(kuò)增的流程。
5.反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（RT control）
可以使用提取好的RNA內(nèi)參基因，RNA假病毒混合基質(zhì)，滅活RNA病毒混合基質(zhì)來(lái)監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄到擴(kuò)增的流程。
無(wú)反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（no-RT control）含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分。
6.空白對(duì)照（Blank control）
6.1無(wú)模板空白對(duì)照
NTC是指不含有模板（陽(yáng)性模板或者陰性模板）的對(duì)照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實(shí)兩者有不同的作用。
6.2儀器空白對(duì)照
NTC是含有引物探針和反應(yīng)液主要監(jiān)控引物探針，反應(yīng)體系有沒(méi)有被污染。這里的儀器空白對(duì)照我通常使用的是空反應(yīng)管來(lái)監(jiān)控儀器有無(wú)非特異性的熒光信號(hào)。
6.3熒光染料對(duì)照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號(hào)在每個(gè)樣品孔會(huì)有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統(tǒng)可以根據(jù)ROX熒光染料的信號(hào)值來(lái)校準(zhǔn)每孔的熒光信號(hào)。
7.質(zhì)控品（Quality control, QC）
上述環(huán)節(jié)中使用的各種對(duì)照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實(shí)驗(yàn)室自制，所以整個(gè)的監(jiān)控過(guò)程可能存在不夠客觀和獨(dú)立。因此在實(shí)驗(yàn)室的對(duì)照設(shè)置中每次檢測(cè)都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference material ,RM)。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確量值和計(jì)量溯源性，可以更準(zhǔn)確的評(píng)估整個(gè)試驗(yàn)流程的準(zhǔn)確度。
8.定值參考品
醫(yī)學(xué)上的定量檢測(cè)試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測(cè)使用。
三、對(duì)照的選擇
從上文可知沒(méi)有一種對(duì)照是完M的，在檢測(cè)中我們要根據(jù)自己的需求來(lái)進(jìn)行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測(cè)時(shí)添加一個(gè)能對(duì)從提取到擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類型為相對(duì)固定的動(dòng)物組織建議使用內(nèi)參基因）；擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增陰性對(duì)照，無(wú)模板對(duì)照和ROX對(duì)照。有條件的添加臨床陽(yáng)性對(duì)照和臨床陰性對(duì)照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)使用核酸提取對(duì)照和反轉(zhuǎn)錄對(duì)照。不定期使用儀器空白對(duì)照。
陽(yáng)性對(duì)照與污染
不可否認(rèn)的一個(gè)事實(shí)是陽(yáng)性對(duì)照可以增加實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)。這種污染的來(lái)源一種是直接來(lái)源于擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照的污染。對(duì)于擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照來(lái)說(shuō)通常10000拷貝/微升（CT值約25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置在CT值20以下，比大部分陽(yáng)性樣本都強(qiáng)。這么高濃度的對(duì)照給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了巨大的污染風(fēng)險(xiǎn)，原因可能僅僅是因?yàn)樵噭S家擔(dān)心其陽(yáng)性對(duì)照不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間存放陽(yáng)性對(duì)照降解。另一種污染來(lái)自于擴(kuò)增產(chǎn)物的處理不當(dāng)，或者實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)布局不合理。
初篩和確診
對(duì)照與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡年P(guān)系好像從來(lái)沒(méi)有人提及過(guò)。根據(jù)筆者多年在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，分享一點(diǎn)個(gè)人的心得，歡迎大家批評(píng)指正。
對(duì)于初篩實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陽(yáng)性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測(cè)系統(tǒng)達(dá)到最高檢測(cè)效率，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陽(yáng)性對(duì)照，確保每個(gè)環(huán)節(jié)的檢測(cè)效率Z高。
對(duì)于確診實(shí)驗(yàn)，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測(cè)系統(tǒng)不出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陰性對(duì)照，減少非必須的陽(yáng)性對(duì)照，甚至要在樣品盤(pán)的不同位置中隨機(jī)插入幾個(gè)陰性對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有被污染。
四、熒光定量PCR的應(yīng)用
分子生物學(xué)研究
1 核酸定量分析 對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測(cè) , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等。
2 基因表達(dá)差異分析 比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證
3 SNP 檢測(cè) 檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測(cè)將會(huì)變得簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。
4 甲基化檢測(cè) 甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報(bào)道了一種稱作 Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
醫(yī)學(xué)研究
5 產(chǎn)前診斷 人們對(duì)遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無(wú)法治療，到目前為止，還只能只能通過(guò)產(chǎn)前監(jiān)測(cè)，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少 X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其Y性別決定區(qū)基因是一種無(wú)創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。
6 病原體檢測(cè) 采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、 結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測(cè)定。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
7 藥物療效考核 對(duì)乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過(guò)程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。
8 腫瘤基因檢測(cè) 盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR不但能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)。