熒光定量pcr原理和步驟

熒光定量pcr是一種新興的pcr技術(shù)，它通過熒光染料或熒光標(biāo)記的具有特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，可以實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度，也被稱為實(shí)時(shí)熒光定量pcr。

一、熒光定量pcr特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

1、傳統(tǒng)定量PCR方法

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，Z終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

2、熒光定量pcr vs 傳統(tǒng)定量PCR

熒光定量pcr是從傳統(tǒng)基于凝膠的低通量PCR技術(shù)發(fā)展而來的高通量的熒光分析技術(shù)，是一種實(shí)時(shí)定量PCR方法。

實(shí)時(shí)定量PCR是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。

二、熒光定量pcr的兩種方法類型

熒光定量pcr常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）

1、熒光染料摻入法

熒光染料摻入法原理是：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。

此方法適用：

a、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。 

b、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上 

d、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。 

e、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。

f、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè) 

2、探針法

探針法熒光定量pcr原理是：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步 

此方法適用：

a、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)。 

b、具有高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。 

c、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量。 

d、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。 

e、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測(cè)。 

f、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè),畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫,生物制品的鑒定。

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

熒光定量PCR是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的。經(jīng)過二十年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷各型肝炎、艾滋病、禽 LIU感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；臨床疾病診斷、禽LIU感、新城疫、口蹄疫、豬瘟等動(dòng)物疾病檢測(cè)；食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因研究等食品安全操作。等等各個(gè)領(lǐng)域。

1、基因分型

例如SNP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。

SNP檢測(cè)是確定一對(duì)染色體的每種基因的兩個(gè)拷貝，哪種點(diǎn)突變?cè)谶@兩個(gè)拷貝中存在，因此利用熒光定量PCR方法，并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測(cè)到SNP結(jié)果。

DNA甲基化是Z早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。

2、基因表達(dá)差異分析

例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證 。

基因表達(dá)差異通常是指一個(gè)基因在兩個(gè)條件中表達(dá)水平的檢測(cè)值在排除實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)等因素外，達(dá)到一定的差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也具有生物學(xué)意義。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等?；蚴Щ钍侵咐梅戳x技術(shù)，使非正?；蚧蛴泻虿槐磉_(dá)或降低表達(dá)活性，以達(dá)到治療某些特定疾病的目的。