怎么整板都沒(méi)有擴(kuò)增曲線，是哪一步實(shí)驗(yàn)出問(wèn)題了嗎？
這個(gè)病原體這段時(shí)間怎么經(jīng)常檢出？不會(huì)是有污染了吧？
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在您看到熒光定量PCR結(jié)果的時(shí)候是否也有過(guò)這樣的疑問(wèn)？隱隱約約感覺(jué)實(shí)驗(yàn)?zāi)硞€(gè)步驟出現(xiàn)問(wèn)題，卻又不知該從何下手。別擔(dān)心，有“對(duì)照精靈”們來(lái)助您一臂之力。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，從樣本采集到結(jié)果分析包含多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，針對(duì)不同的步驟，可以選擇不同的對(duì)照對(duì)流程進(jìn)行監(jiān)控（圖1）。
圖1. 實(shí)驗(yàn)流程和常見(jiàn)陰陽(yáng)性對(duì)照種類(lèi)。
熒光定量PCR的靈敏度可以達(dá)到1拷貝/孔，如此高靈敏度的檢測(cè)手段對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染也非常敏感，我們也無(wú)法從單一孔中的擴(kuò)增曲線來(lái)判斷是否來(lái)源于污染還是來(lái)源于真實(shí)樣本的擴(kuò)增。這時(shí)，就需要陰性對(duì)照來(lái)監(jiān)控和發(fā)現(xiàn)污染的發(fā)生。常用的陰性對(duì)照包括以下幾種：
使用水代替定量PCR反應(yīng)中的核酸，其它試劑照常加入，用于監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的污染。正常情況下，NTC孔不會(huì)有擴(kuò)增；當(dāng)NTC出現(xiàn)擴(kuò)增，則預(yù)示體系中有污染。在SYBR Green實(shí)驗(yàn)中，NTC出現(xiàn)擴(kuò)增也可能是來(lái)源于引物二聚體的形成，此時(shí)則需要通過(guò)優(yōu)化引物的設(shè)計(jì)來(lái)減少引物二聚體對(duì)結(jié)果的影響。
No Reverse-Transcriptase Control, No RT
當(dāng)進(jìn)行RNA定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果引物和探針設(shè)計(jì)在同一個(gè)外顯子上，就無(wú)法從結(jié)果中判斷擴(kuò)增是否來(lái)源于未去除干凈的DNA，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。除了在引物和探針設(shè)計(jì)上面下功夫，還可以設(shè)置無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)照。即在逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，不加逆轉(zhuǎn)錄酶，并進(jìn)行后續(xù)的定量PCR檢測(cè)。無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照中由于沒(méi)有cDNA，DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增mRNA，則不應(yīng)發(fā)生擴(kuò)增。如果檢測(cè)到擴(kuò)增，則樣本中可能含有未去除干凈的DNA。陰性樣本指不含有目的基因或者靶序列的樣本，也可以是樣本保存液。從核酸提取開(kāi)始做起，經(jīng)歷提取、逆轉(zhuǎn)錄（如有）和擴(kuò)增過(guò)程。如果出現(xiàn)擴(kuò)增，則說(shuō)明其中某一實(shí)驗(yàn)步驟中存在污染，結(jié)合NTC結(jié)果，可以判斷是否是樣本提取過(guò)程中引入的污染。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)從樣本采集到最后的結(jié)果分析分為幾個(gè)步驟完成，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。當(dāng)出現(xiàn)一個(gè)無(wú)擴(kuò)增或者Ct值偏大的樣本孔，到底是真的沒(méi)有要檢測(cè)的對(duì)象，還是擴(kuò)增有問(wèn)題，亦或是提取中的問(wèn)題？為了發(fā)現(xiàn)這種假陰性的發(fā)生，合理的陽(yáng)性對(duì)照可以監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的不同步驟：
可使用含有擴(kuò)增片段的質(zhì)粒、假病毒或者基因組DNA/cDNA作為擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控?zé)晒舛縋CR的體系是否正常，包括酶、引物、探針等。如果檢測(cè)中包含多個(gè)目標(biāo)片段，可以將這些目標(biāo)片段都克隆到同一個(gè)質(zhì)粒中，方便制備和使用。當(dāng)擴(kuò)增對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增，或者Ct值大于預(yù)期，則說(shuō)明定量PCR體系存在問(wèn)題。
Internal Positive Control, IPC
如果想監(jiān)控每一份樣本從核酸提取到逆轉(zhuǎn)錄以及最后的熒光定量PCR的過(guò)程，可以在提取之前在每個(gè)樣本中加入一段外源DNA或RNA（不含目的片段）（表1），并在定量PCR時(shí)進(jìn)行單管多重PCR，同時(shí)檢測(cè)目的基因和這段序列。在每個(gè)樣本中加入特定拷貝數(shù)的IPC，進(jìn)而從該段序列的Ct值判斷對(duì)應(yīng)樣品孔中的核酸富集和擴(kuò)增效率。也可以選擇的逆轉(zhuǎn)錄或者擴(kuò)增的時(shí)候加入到每一個(gè)樣本孔中，單獨(dú)監(jiān)測(cè)純化后的核酸中是否含有逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增抑制劑（圖2）。
表1：陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照和相關(guān)試劑盒
圖2：通過(guò)IPC提示體系中抑制劑的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為同樣濃度的RNA加入相同拷貝Xeno IPC，在不同濃度的擴(kuò)增抑制劑血紅素存在下（0-4μM），Xeno IPC的Ct值與目標(biāo)RNA的Ct值定量結(jié)果。
陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照雖然可以在一定程度上反應(yīng)核酸提取效率，但是卻很難反饋提取流程中對(duì)核酸釋放的效率。一些病原體的樣本，尤其是含有革蘭氏陽(yáng)性菌或者真菌樣本，充分的酶消化或者機(jī)械裂解對(duì)于最終檢測(cè)的靈敏度有顯著影響。為了能更好的反映提取效率，可以選擇已知陽(yáng)性的樣本或者保存在相似基質(zhì)中已知濃度的病原體，作為單獨(dú)的樣本進(jìn)行提取和后續(xù)的RT-PCR，通過(guò)Ct值評(píng)斷實(shí)驗(yàn)流程。上面提到的陽(yáng)性對(duì)照能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)流程提供很多質(zhì)控信息。對(duì)于樣本本身的質(zhì)量，比如拭子是否刮取到樣本、RNA在運(yùn)輸和保存過(guò)程中是否有嚴(yán)重的降解等問(wèn)題，則可以通過(guò)對(duì)內(nèi)參基因的定量來(lái)幫助回答。
內(nèi)參基因一般選擇在取樣組織或細(xì)胞中均有足量表達(dá)的基因，且其表達(dá)量不受環(huán)境、實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件和取樣時(shí)間等因素影響， 如管家基因（housekeeping gene）。常用人類(lèi)內(nèi)參基因如表2所示。要注意沒(méi)有某個(gè)內(nèi)參基因是萬(wàn)能的，需要根據(jù)樣本類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)處理方式進(jìn)行評(píng)估和選擇（可參考Application Note: Using TaqMan Endogenous Control Assays to select an endogenous control）。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)內(nèi)參基因的Ct值來(lái)判斷取樣和樣本降解情況。在相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因亦可用于對(duì)取樣量進(jìn)行均一化。
如果進(jìn)行的是單管多重實(shí)驗(yàn)，還需考慮內(nèi)參基因的表達(dá)量。當(dāng)內(nèi)參基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于目的基因時(shí)，內(nèi)參基因?qū)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增，體系中的原料消耗速度過(guò)快，造成目的基因擴(kuò)增效率降低。此時(shí)可以選擇引物濃度降低的TaqMan試劑盒（Primer-Limited）對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行測(cè)定。
表2：常用人類(lèi)內(nèi)參基因試劑盒（cDNA）
如何避免污染發(fā)生？出現(xiàn)污染怎么辦？
為了避免樣本之間的交叉污染，規(guī)范化的取樣和樣本保存非常重要。不同樣本移液時(shí)謹(jǐn)記更換槍頭，并盡量使用帶濾芯的槍頭；不同樣本盡量避免同時(shí)開(kāi)蓋或劇烈震蕩樣本，也要避免反復(fù)吹吸導(dǎo)至的氣溶膠形成和擴(kuò)散。一旦發(fā)生樣本溢出，應(yīng)馬上進(jìn)行清污，降低對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成的影響。
對(duì)于核酸提取儀、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、超凈臺(tái)等可在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用70%的乙醇或者10%的次氯酸鈉（具腐蝕性，建議使用前咨詢?cè)O(shè)備供應(yīng)商）擦拭或者利用紫外線照射5-20分鐘進(jìn)行表面清潔。如果需要對(duì)殘留的核酸進(jìn)行更*的清潔， DNAZap™ PCR DNA Degradation Solutions能更有針對(duì)性地降解儀器和臺(tái)面上殘留的DNA和RNA。
按照標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)要求，在清潔度最高的“試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)”進(jìn)行試劑的制備、分裝和預(yù)混液的制備。大包裝的qPCR試劑開(kāi)封后進(jìn)行分裝，以減少反復(fù)凍融和吸取次數(shù)。在做多樣本PCR反應(yīng)時(shí)，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸。避免同時(shí)開(kāi)蓋，實(shí)現(xiàn)*閉管操作。實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同處。 前次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物殘余污染
標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)通過(guò)“標(biāo)本制備區(qū)”和“擴(kuò)增區(qū)”分割開(kāi)PCR體系配置和PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。如果不具備這樣的條件，首先要避免熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后開(kāi)蓋，以防擴(kuò)增產(chǎn)物形成氣溶膠對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成污染。少量意外開(kāi)蓋不能避免時(shí)，可以使用含有UNG酶（uracil-N-glycoslyase, 尿嘧啶DNA糖基化酶）的擴(kuò)增預(yù)混液。如果在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP參入到PCR產(chǎn)物中，形成了含有dUTP的擴(kuò)增產(chǎn)物，UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈 DNA 中 U 堿基的糖苷鍵， 降解 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)于熱敏感性的UNG酶，50℃溫度即可失活，不影響本次擴(kuò)增片段。
通過(guò)以上介紹，相信大家已經(jīng)對(duì)不同的對(duì)照種類(lèi)和用途有了足夠的了解，在實(shí)踐中還需要針對(duì)具體需求進(jìn)行選擇。合理的對(duì)照能讓我們及時(shí)發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題，而規(guī)范的操作流程和良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣才能在根源上避免這些問(wèn)題的發(fā)生。雙劍合并才能放心地收獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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