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E14小鼠胚胎干細(xì)胞
細(xì)胞描述
小鼠胚胎干細(xì)胞。該細(xì)胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且對(duì) 0.06 mM 的 6-硫鳥(niǎo)嘌呤有抗性。當(dāng)在飼養(yǎng)層（胚胎成纖維細(xì)胞或 STO 細(xì)胞）上培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞保持未分化狀態(tài)。在沒(méi)有飼養(yǎng)層的情況下，細(xì)胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當(dāng)注入胚泡中時(shí)，細(xì)胞可以進(jìn)入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后，它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。培養(yǎng)時(shí)需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
細(xì)胞特性
1） 來(lái)源：小鼠，129/Ola品系，胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)
2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長(zhǎng)
3） 含量：>1x10^6 細(xì)胞數(shù)
4） 規(guī)格：1mL凍存管包裝
5） 用途：僅供科研使用
E14小鼠胚胎干細(xì)胞
運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸：1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (0001) 81%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 （0500） 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 ( 0900 ) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (01000) 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 ( 01100 ) 1%
P/S青霉素-鏈霉素 （15140-122） 1%
β-巰基乙醇 (8211) 0.5 mL（1000X)
LIF (50756) 5μg（10ng/mL）
使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：*培養(yǎng)液 60%%，F(xiàn)BS 30%%，DMSO 10%%現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r(shí)，體積為 500 μl，預(yù)期存活率 70%，每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇，3 至4 天后，會(huì)形成 30 至 40 個(gè)克隆，建議復(fù)蘇至 1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中。
二：細(xì)胞處理：
MEF 細(xì)胞鋪制：
1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF *培養(yǎng)液。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF *培養(yǎng)液。
3. 按實(shí)驗(yàn)需要：小鼠胚胎干細(xì)胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復(fù)蘇 MEF 細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF *培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF *培養(yǎng)液 1 ml，重懸后按照一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶鋪 1′106 的 MEF 細(xì)胞，平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。
5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞前，將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF *培養(yǎng)液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液待用。
復(fù)蘇：
1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液。
傳代：
1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。
傳代比例：1:4-1:7
凍存：
1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。
2. 以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)夜，轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方：
小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液 60%，ES 級(jí) FBS 30%，DMSO 10%
附：小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）：
1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無(wú) MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過(guò)快無(wú)法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時(shí)。
3. 1 小時(shí)后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
