實(shí)驗(yàn)材料：

1.    膠原酶消化的脾臟細(xì)胞懸液

2.    高密度牛血清白蛋白（BSA）溶液

3.    RPMI 1640培養(yǎng)基（如Life Technologies），4℃和37℃

4.    RPMI-5*培養(yǎng)基，4℃和37℃

5.    抗體偶聯(lián)的綿羊紅細(xì)胞（EA）

6.    用于流式細(xì)胞分析的一抗

7.    用于流式細(xì)胞分析的二抗（熒光結(jié)合的小鼠抗大鼠IgG和IgM；如Boehringer Mannheim）

8.    Beckman GH-3.7和Sorvall HS-4轉(zhuǎn)子

9.    15ml和50ml聚丙烯錐底管

10.  填充棉花和未充填棉花的高壓滅菌的9in（約23cm）巴氏吸管，直徑60mm的組織培養(yǎng)皿（如Falcon）

 

實(shí)驗(yàn)方法：

1.    將膠原酶消化的脾臟細(xì)胞懸液于4℃，280g離心10min，棄上清。用高密度BSA迅速重懸沉淀物，每個(gè)脾臟約1ml。

2.    準(zhǔn)備BSA柱：將5-6ml細(xì)胞懸液加入15ml離心管中，在懸液上小心加入4℃ 1.5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，形成一明細(xì)界面。用此種方法準(zhǔn)備4或5個(gè)BSA柱，直至分完細(xì)胞懸液。

3.    將BSA柱于4℃，9500g離心15min，緩慢加速，注意關(guān)掉“brake"開(kāi)關(guān)。

4.    小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面得細(xì)胞，吸走全部的RPMI-1640和頂部1ml BSA，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一干凈的50ml離心管中（棄沉淀）。用4℃的RPMI-1640充滿(mǎn)離心管以稀釋BSA，緩慢搖動(dòng)混勻。

5.    于4℃，280g離心10min后棄上清。重懸細(xì)胞于5-10ml RPMI-5*培養(yǎng)基后置于冰上。

6.    臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞（一個(gè)脾臟可得到10⁷個(gè)低密度的脾臟細(xì)胞）。

7.    用RPMI-5*培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至大約10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。每4ml懸液接種至60mm培養(yǎng)皿內(nèi)直至全部細(xì)胞鋪板完畢。培養(yǎng)90min使DC粘附。

8.    棄非粘附細(xì)胞：用充填棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-1640培養(yǎng)基，小心清洗培養(yǎng)皿表面，去除懸浮的細(xì)胞，直至培養(yǎng)皿表面由粗糙渾濁變?yōu)楣饣⒔跚辶?。重?fù)洗滌一次。

9.    每個(gè)培養(yǎng)皿加入4ml 37℃ RPMI-1640培養(yǎng)基并培養(yǎng)30-60min以去除粘附的淋巴細(xì)胞。重復(fù)步驟8。

10.    于倒置顯微鏡下利用相差觀察培養(yǎng)皿?？梢?jiàn)大部分深色星形樹(shù)突細(xì)胞、一些明亮扁平的巨噬細(xì)胞，以及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞之類(lèi)的圓形細(xì)胞。如果樹(shù)突細(xì)胞比例不高，則重復(fù)步驟8、9。

11.    用4ml干凈的RPMI-5*培養(yǎng)基替換每個(gè)培養(yǎng)皿中的液體，培養(yǎng)12-20h。

12.    用填充棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-5*培養(yǎng)基洗滌平皿。將洗下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入置于冰上的15ml離心管中（每管可裝3個(gè)平皿的洗滌細(xì)胞）。用2ml RPMI-5*培養(yǎng)基洗滌平皿。重復(fù)該操作直到培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞收集完畢。

13.    將收集的細(xì)胞于4℃，280g離心10min，棄上清。用1ml干凈的RPMI-5*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后置于冰上。

14.    臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞（0.5×10⁶-1.0×10⁶個(gè)細(xì)胞/脾臟，約80%為DC）。

15.    按每個(gè)白細(xì)胞50個(gè)EA（抗體偶聯(lián)的綿羊紅細(xì)胞）的量加入EA（以結(jié)合B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），顛倒混勻。4℃，70g離心10min。離心后不棄上清，直接將離心管置于冰上30min。

16.    吸棄部分培養(yǎng)基，剩下2-2.5ml。用填充棉花的巴氏吸管輕微吹打細(xì)胞懸液10-15次以吹散大的團(tuán)塊但是不破壞玫瑰花結(jié)。

17.    將重懸的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)器檢查以確認(rèn)是否每個(gè)玫瑰花結(jié)都是一個(gè)白細(xì)胞周?chē)鷩@著紅細(xì)胞。如果有必要，再次懸浮細(xì)胞。

18.    制備BSA柱：將5ml高密度的BSA加入至15ml的離心管中，小心地將2.5ml玫瑰花結(jié)懸液加到液面上，從而形成一清晰地界面。

19.    離心并收集細(xì)胞同步驟3-6（2×10⁵-7×10⁵個(gè)細(xì)胞/脾臟，大于95%為DC）。

20.    用一抗標(biāo)記DC用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。對(duì)于二抗，用熒光結(jié)合的小鼠抗大鼠IgG和IgM。

 

附錄：

    抗體偶聯(lián)的綿羊紅細(xì)胞（EA）：

以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細(xì)胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗滌后均以350g離心5min。然后用新鮮PBS稀釋為5%細(xì)胞懸浮液（10⁹個(gè)細(xì)胞/ml）。將高致敏的兔抗紅細(xì)胞血清于5%細(xì)胞懸液以1：50稀釋?zhuān)赡苄纬蓙喣瘎┝康目贵w）。室溫下孵育2h，偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次，隨后以PBS將EA稀釋為5%細(xì)胞懸液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗滌一次。

 

RPMI-5*培養(yǎng)基：

        RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies），含有：

        5%FBS，56℃熱滅活1h

        10mmol/L HEPES

        20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）

        50mmol/ml 2-ME

        過(guò)濾除菌

 

    高密度BSA溶液：

在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液體不要再瓶?jī)?nèi)飛濺）。不要攪拌，將106g BSA（Cohn fraction V，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面，蓋上錫紙，冷藏過(guò)夜，使BSA慢慢溶解。

第二天，溫和搖晃已變?yōu)槌吻?、微褐色的溶液；測(cè)量折射指數(shù)，精確到小數(shù)點(diǎn)后第四位。25℃條件下，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數(shù)在1.384-1.385。為校正折射指數(shù)后，用試紙檢測(cè)pH。pH應(yīng)在7.0-7.4，一般無(wú)需調(diào)整。

無(wú)菌過(guò)濾溶液。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個(gè)500ml的過(guò)濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部，先以少量BSA潤(rùn)濕濾膜。真空抽濾數(shù)分鐘，直到BSA濾出為止。取下真空泵，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲(chǔ)存器中（避免起泡沫。使用真空泵和濾器過(guò)濾剩余的BSA，≥10min）。4℃可保存3個(gè)月。