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原代上皮細(xì)胞與原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的分離純化
PriCells-原代上皮細(xì)胞與原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的分離純化
原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長，既有上皮樣細(xì)胞又有纖維樣細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等。混雜的細(xì)胞會直接影響實驗結(jié)果。
在體外培養(yǎng)原代細(xì)胞時，為了保證實驗結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性、和可重復(fù)性，要求采用單一種類細(xì)胞來進行實驗，這樣才能對某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等變化進行一系列研究，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實驗研究的重要一步，甚至需要從混雜的細(xì)胞群中分離出單個細(xì)胞來進行培養(yǎng)和開展實驗研究。
一、原代細(xì)胞增殖優(yōu)勢純化方法：
自然純化是利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長優(yōu)勢旺盛的細(xì)胞，達到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無法按照需要和實驗要求及研究目的來選擇細(xì)胞。此法花費時間長，留下的往往是成纖維細(xì)胞。僅有那些惡變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過此方法而保留下來的，不斷純化而建立細(xì)胞系。
二、原代細(xì)胞常用純化方法：
人工純化是利用人為手段造成對某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達到純化細(xì)胞的目的。
1、細(xì)胞時間差酶消化法：
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細(xì)胞可行，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同，是兩者分開，達到純化的目的；另外對貼壁細(xì)胞與半貼壁細(xì)胞及黏附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開，方法步驟如下：
- 采用常規(guī)消化傳代方式將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1ml（25ml培養(yǎng)瓶），來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面，然后倒掉。
- 蓋好瓶塞，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞變園，部分脫落，立即加入2ml有血清的培養(yǎng)基終止消化。
- 用彎頭吸管輕輕吹打成纖維細(xì)胞生長區(qū)域（可事先在鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號）。吹打時不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)基漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)基于瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進行一次。
- 隔幾日后或下次傳代時，再進行上述操作，進過幾次處理，就可將成纖維細(xì)胞去除或者將兩者分開。
2、細(xì)胞培養(yǎng)機械刮除法：
原代培養(yǎng)時，如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分為區(qū)成混雜生長，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，其方法步驟如下 ：
- 將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進行操作。
- 用硅橡膠刮子在不需要生長的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，注意不要傷及所需細(xì)胞。
- 推劃后用培養(yǎng)基沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
- 數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長出，可再進行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過程中要嚴(yán)格無菌操作，防止污染。
3、細(xì)胞反復(fù)貼壁法：
成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞能在短時間內(nèi)（大約10-30min）完成附著過程（但不一定*伸展），而上皮細(xì)胞（大部分）在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細(xì)胞。
- 將細(xì)胞懸液接種在一個培養(yǎng)內(nèi)（最好培養(yǎng)基內(nèi)不含血清，此時上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20min。
- 在倒置顯微鏡下觀察，見部分細(xì)胞貼壁，稍加搖動也不浮起時，將細(xì)胞懸液導(dǎo)入另一培養(yǎng)瓶中。
- 繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后重復(fù)上述操作后，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開，在第一瓶和第二瓶以成纖維細(xì)胞為主，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主，下次傳代時再按上述方法處理，就可使兩者達到*分開的目的。
4、細(xì)胞電烙篩選法：
在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集、排列規(guī)則，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限，此時即可用機械刮除法取出未轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。
- 倒去原液，并用記號筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域。
- 用加熱的微型電烙器（類似焊接用的電烙鐵）將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。在單細(xì)胞克隆篩選時，也可用此法將單個細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死。
- 然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是原液）繼續(xù)培養(yǎng)，即可達到純化的目的。