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細(xì)胞基本信息

▼細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

細(xì)胞名稱：  RAW 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)

細(xì)胞別稱：  RAW264; RAW2647; RAW264.7; RAW-264.7; Raw 264.7; Raw264.7

細(xì)胞貨號：  SNL-112

生長特性：  半貼壁細(xì)胞

培養(yǎng)條件：   DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境：  空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細(xì)胞簡介：  RAW 264.7細(xì)胞是從Abelson小鼠白血病病毒（MuLV）誘導(dǎo)的腫瘤中建立的雄性小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，Raschke等人于1976年首*報道了該細(xì)胞系。RAW 264.7細(xì)胞sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW 264.7細(xì)胞不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點形成試驗陰性。根據(jù)Janet W.Hartley博士在2008年發(fā)表的一項研究，RAW 264.7細(xì)胞被證明表達生態(tài)性和多向性MuLV，并且使用XC噬斑試驗對病毒復(fù)制呈陽性。RAW 264.7細(xì)胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖，并且可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞。LPS或PPD處理2天可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分解紅血球，但對腫瘤靶細(xì)胞無作用。RAW 264.7細(xì)胞易于繁殖，DNA轉(zhuǎn)染效率高，對RNA干擾敏感，并支持小鼠諾如病毒的復(fù)制，可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、免疫系統(tǒng)紊亂和免疫學(xué)研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

1. 存在少量分化細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞形態(tài)主要為圓形。因其對環(huán)境非常敏感，在培養(yǎng)時會出現(xiàn)少量短梭形或多角形的分化細(xì)胞，這是正?，F(xiàn)象。分化的細(xì)胞貼壁牢固，而未分化的細(xì)胞貼壁松散。根據(jù)貼壁松緊差異，可將未分化的細(xì)胞吹下，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

2. 對胰酶敏感

RAW264.7細(xì)胞對胰蛋白酶敏感，接觸胰酶后將很快發(fā)生自發(fā)分化，貼壁變緊，很難消化下來。所以不建議用胰酶對該細(xì)胞進行傳代。（詳細(xì)傳代步驟見下文）

3. 生長較快

RAW264.7細(xì)胞生長速度較快，建議每天觀察細(xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞密度到達80%時及時進行傳代，以防細(xì)胞過度生長狀態(tài)變差。

RAW264.7細(xì)胞傳代方法

1.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）

2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清，留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面吹下細(xì)胞；

2. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，900rpm 離心 3-5min，棄上清；

3. 加新的完*培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里；

4. 補足完*培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

Tips：吹打次數(shù)不宜過多，吹打力度保持輕柔，以免機械刺激造成細(xì)胞自分化或損傷。

RAW264.7細(xì)胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips：

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

T25培養(yǎng)瓶長滿通?？蓛龃?-3管，10cm皿長滿通?？蓛龃?-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速；

2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；

5. 復(fù)蘇24小時后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

RAW264.7細(xì)胞收貨方法

常溫細(xì)胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多，應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；

Tips：

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

常見問題及解決方案

 細(xì)胞密度怎么計算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

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