細 胞 基 本 情 況
▲細胞正常生長形態(tài)照片
細胞名稱：PK-15(豬腎細胞)
細胞別稱： PK(15); PK (15); PK 15; PK15; Porcine Kidney-15
細胞貨號: SNL-131
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%
細胞簡介: PK-15細胞是由Stice·E于1955年從成年豬的腎臟中分離后建系的，是PK-2a細胞的克隆系。PK-15細胞豬圓環(huán)病毒（PCV）抗原陽性，表達纖溶酶原激活劑、角蛋白，可用于多種病毒的增值及特性研究。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PK-15細胞內(nèi)有C-型病毒顆粒存在，是研究C-型病毒的材料。美國農(nóng)業(yè)部的外國動物疾病診斷實驗室已經(jīng)確定ATCC CCL-33沒有感染霍亂病毒或非洲豬瘟病毒，可以用來篩選這些病毒。
PK-15(豬腎細胞)特點
01 細胞貼壁較強
細胞貼壁略偏強，消化時易出現(xiàn)消化時間偏長現(xiàn)象，注意一定要消化到細胞可以輕輕吹下，再加終止液終止消化；
02 細胞顆粒比較多
該細胞培養(yǎng)過程中代謝會產(chǎn)生較多顆粒物，細胞內(nèi)部及細胞周邊可以明顯看到很多顆粒，此為該細胞正?，F(xiàn)象，并不代表細胞狀態(tài)不佳或污染；消化操作不規(guī)范、培養(yǎng)條件不適等會導致細胞顆粒進一步增加，嚴重的可能會出現(xiàn)細胞不長甚至死亡，對環(huán)境和操作要求偏高；
細胞顆粒較多時可以收集細胞后低速離心并用PBS重懸后再低速離心，重復1-2次后再接種到新的培養(yǎng)瓶中；
03 細胞消耗培養(yǎng)基偏快
細胞培養(yǎng)基消耗速度偏快，必須多加點培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，T25瓶加10-12ml完*培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次；
細 胞 收 貨 攻 略
常溫細胞
1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；
凍存細胞
1.細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完*揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
2.凍存細胞建議盡快復蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；
3.復蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導下進行下一步操作；
TIPS:
1.細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
2.該細胞運輸過程中由于條件不適，顆粒可能會增多，一定要充分平衡細胞后再處理，有條件的建議放培養(yǎng)箱過夜再處理細胞；
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應細胞的完*培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；
細 胞 傳 代 攻 略
1. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
2. T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
3. 消化到細胞間隙變大，但未完*脫落時加2-3ml完*培養(yǎng)基終止胰酶消化；
4. 混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
5. 加新的完*培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補足完*培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
TIPS:
1. 該細胞對消化時間偏長，注意略微延長消化時間；
2. 對于消化細胞程度，客戶如果經(jīng)驗不多，無法準確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現(xiàn)機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；
3. T25瓶加10-12ml完*培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。
4. 細胞收貨后首*傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；
5. 傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；
細 胞 凍 存 攻 略
凍存步驟
1. 先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；
2. 加入適量預先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標記的凍存管中；
3. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
4. 轉(zhuǎn)移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；
TIPS:
1. 檢測凍存細胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認凍存合格方可視需要丟棄；
2. 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；
3. T25培養(yǎng)瓶長滿通?？梢詢龃?-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；
細 胞 復 蘇 攻 略
復蘇步驟
1. 將所需的完*培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預熱30min后開始復蘇；
2. 準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水??；
3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異；
4. 離心完成后棄凍存液，用剛才預熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
5. 24h后觀察細胞并換液一次，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
TIPS:
1. 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴；
2. 水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；
3. 水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；
4. 建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞；
5. 復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；
常見問題及解決方案
細胞密度怎么計算的？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準。
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