細 胞 基 本 信 息
細胞正常生長形態(tài)
細胞名稱: A-375(人惡性黑色素瘤細胞)
細胞別稱: A 375; A375; A375-MEL; A375-mel; A375mel
細胞貨號: SNL-065
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%
細胞簡介: A-375細胞源自患有惡性黑色素瘤的女性患者的皮膚，是由D·J·Giard等人建立的一系列細胞株中的一株。A-375細胞在抗胸腺細胞球蛋白、血清處理的NIH瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長的皮下腫瘤，A-375細胞可以在普通成纖維細胞飼養(yǎng)層和瓊脂上形成克隆。A-375細胞是NRAS mutant-A375 isogenic理想對照，可用于3D細胞培養(yǎng)、高通量篩選、毒理學(xué)和免疫腫瘤學(xué)研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
A-375（人惡性黑色素瘤細胞）特點
01細胞顆粒感較重
細胞傳代培養(yǎng)時細胞內(nèi)黑點及細胞外顆粒較多，建議使用優(yōu)質(zhì)血清及培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；
02傳代、復(fù)蘇注意細胞狀態(tài)
細胞消化或者復(fù)蘇操作不當(dāng)容易導(dǎo)致細胞死亡裂解產(chǎn)生大量碎片及顆粒，進而影響活細胞狀態(tài)，注意消化或復(fù)蘇過程盡量輕柔，嚴(yán)格控制消化時間和復(fù)蘇操作規(guī)范，傳代或復(fù)蘇24h后建議觀察細胞，建議換液一次去除死亡細胞；
細 胞 收 貨 攻 略
常溫細胞
1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；
凍存細胞
1.細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
2.凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
3.復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；
Tips：
1.細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
2.該細胞貼壁生長，一般T25瓶運輸過程中較少出現(xiàn)大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態(tài)，不影響細胞生長，按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；
細 胞 傳 代 攻 略
1.先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
2. T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
3.消化到細胞間隙變大，但未脫落時加2-3ml培養(yǎng)基終止胰酶消化；
4.混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；
5.加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補足培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；
Tips：
1.對于消化細胞程度，客戶如果經(jīng)驗不多，無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應(yīng)盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現(xiàn)機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細胞；
2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。
3. 細胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；
傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；
細胞 凍 存 攻 略
凍存步驟
1.先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；
2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中；
3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
4.轉(zhuǎn)移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；
Tips：
1.檢測凍存細胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄；
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；
3.T25培養(yǎng)瓶長滿通?？梢詢龃?-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；
細 胞 復(fù) 蘇 攻 略
復(fù)蘇步驟
1.將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇；
2.準(zhǔn)備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；
3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異；
4.離心完成后，棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中。
Tips：
1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮蒸發(fā)后再水浴；
2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；
3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞；
5.復(fù)蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細胞；
常見問題及解決方案
細胞密度怎么計算的？
嚴(yán)格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2.細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
NO.3細胞具體消化時間是多久？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準(zhǔn)。
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