F-T0PI0快速轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86034-01(20×100ul)/BFNC86034-02(100×100ul)

F-T0PI0：                                                  100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                            -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG

產(chǎn)品說(shuō)明

T0PI0菌株來(lái)源于MC1061，是目前實(shí)驗(yàn)室常用的感受態(tài)細(xì)胞之一，基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型，而T0PI0為galU型)。T0PI0生長(zhǎng)速度快，37℃，10小時(shí)可見克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取?？捎糜跇?gòu)建克隆，藍(lán)白斑篩選等實(shí)驗(yàn)。

青旗生物生產(chǎn)的F-T0PI0感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，無(wú)需42℃熱激，37℃孵育步驟，只需冰浴，10min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化、涂板操作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1~5×10⁸ cfu/μg DNA。

F-T0PI0快速轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

快速轉(zhuǎn)化操作方法 (10min)

1. 提前15分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱

2. F-T0PI0感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手bo打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。

3. 用200μl槍將感受態(tài)細(xì)胞-DNA混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的2YT或LB培養(yǎng)基上。

4. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少13 h。

快速熱激轉(zhuǎn)化操作方法

(25min,可提高轉(zhuǎn)化效率)

1. F- T0PI0感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘 (晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率)。加入700 μl 不含抗生素的LB，37℃，200 rpm 復(fù)蘇10分鐘，涂板 (均勻，表面無(wú)水漬)。

3. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少15h。

注意事項(xiàng)

1. F-T0PI0快速轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞也可進(jìn)行熱激操作，對(duì)于>7 kb質(zhì)粒的構(gòu)建，為了提高轉(zhuǎn)化效率可按以下步驟操作：F-T0PI0感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，插入冰中，5分鐘后，加入目的DNA并用手bo打EP管底輕輕混勻，冰中靜置20分鐘。42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中靜置2分鐘。加入700 μl LB，37℃，200 rpm復(fù)蘇30分鐘，涂板。

2. 感受態(tài)細(xì)胞適宜在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，混入目的DNA時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. F- T0PI0快速轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂氨芐/羧芐青霉素抗性平板時(shí)效率較高，若涂卡那霉素或其他抗生素平板，轉(zhuǎn)化效率下降(因無(wú)孵育步驟，卡那霉素等對(duì)菌體毒性較大)。若要提高卡那霉素或其他抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率，可按熱激轉(zhuǎn)化操作，增加孵育步驟。