活性氧（羥自由基）測定試劑盒（比色法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1789

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品簡介：

Fenton反應(yīng)是常用的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，H₂O₂的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH^-量成正比，當(dāng)給予電子受體后，通過griess試劑顯色，生成紅色物質(zhì)，其呈色程度與OH^-的多少成正比。

產(chǎn)品組成：

注意：

1. 0.03%標(biāo)準(zhǔn)品工作液的配制：3%H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)貯備液:蒸餾水=1:99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 底物工作液的配制：

① 若您的樣本為抑制羥自由基﹡，即測定管吸光度對比照管吸光度低，則底物工作液的配制：底物貯備液:                       蒸餾水=1:99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

② 若您的樣本為產(chǎn)生羥自由基﹡，即測定管吸光度對比照管吸光度高，則底物工作液的配制：底物貯備液:蒸餾水=1:299稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注﹡：抑制羥自由基的物質(zhì)如：血清（漿），各種組織勻漿液，天然維生素等；

產(chǎn)生羥自由基的物質(zhì)如：中性白細(xì)胞，某些藥物，部分植物提取物等。

3. 試劑C工作液的配制：C-1工作液（試劑C-1用時(shí)加蒸餾水1:9稀釋成工作液，2-8℃保存）與C-2液等比例混合，用多少配多少，余下2-8℃保存。

4. 試劑D用時(shí)加蒸餾水稀釋至100ml，得試劑D工作液，2-8℃保存。

如結(jié)晶，則置37℃水浴中至全部溶解后再稀釋。

5. 顯色劑的配制：試劑D工作液:試劑E:試劑F:冰乙酸=8:3:3:2，需多少配多少，現(xiàn)用現(xiàn)配。

操作步驟：

以上配制好的工作液，在37℃水浴中預(yù)熱3分鐘，以下操作在37℃水浴中進(jìn)行：

混勻，37℃反應(yīng)1分鐘，加完試劑C開始計(jì)時(shí)一分鐘，立即加入顯色劑終止反應(yīng)，一次只能做一只管子。

混勻，室溫放置20分鐘后，1cm光徑，550nm，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

*：參考取樣量：血清（漿）樣本用生理鹽水20倍稀釋后取0.2ml作檢測；或直接取10μL血清（漿），再加190μL 生理鹽水。0.5%組織樣本，取0.2ml檢測。具體取樣量需您自己做預(yù)試確定，詳細(xì)預(yù)試方法見附件。

計(jì)算方法及舉例： 

（一）血清（漿）中抑制羥自由基能力的計(jì)算：

1. 定義：規(guī)定每毫升血清（漿）在37℃下反應(yīng)1分鐘，使反應(yīng)體系中H₂O₂濃度降低1mmol/L為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

2. 公式：

抑制羥自由基能力(U/ml)=×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mM)××樣本測試前稀釋倍數(shù)

3. 計(jì)算舉例：

取用生理鹽水20倍稀釋后的血清0.2ml檢測抗活性氧能力，測得對照管吸光度OD值為0.671， 測定管吸光度OD值為0.349，標(biāo)準(zhǔn)管吸光度OD值為0.443，空白管吸光度OD值為0.001，標(biāo)準(zhǔn)H₂O₂濃度為8.824mmol/L，則計(jì)算如下：

 抑制羥自由基能力(U/ml) =×8.824××20=642.83U/ml血清′ ′ = - =

（二）組織中抑制羥自由基能力的計(jì)算：

1. 定義：規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃下反應(yīng)1分鐘，使反應(yīng)體系中H₂O₂濃度降低1mmol/L為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

2. 公式：

抑制羥自由基能力(U/mgprot)=×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mM)÷ (蛋白毫克數(shù)/ml ×取樣量)

3. 計(jì)算舉例：

取5%小鼠肝組織勻漿0.1ml用生理鹽水10倍稀釋成0.5%肝勻漿，取0.2ml檢測，測得對照管OD為0.843，測定管OD為0.418，標(biāo)準(zhǔn)管OD為0.434，標(biāo)準(zhǔn)空白OD為0.007，標(biāo)準(zhǔn)濃度為8.824mmol/L，0.5%小鼠肝勻漿的蛋白為0.486mg/ml。 ′ ? ′ = - =

抑制羥自由基能力(U/mgprot)=×8.824÷ (0.486 ×0.2)= 90.36U/mgprot

（三）溶血液中抑制羥自由基能力的計(jì)算：

1. 定義：規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃下反應(yīng)1分鐘，使反應(yīng)體系中H₂O₂濃度降低1mmol/L為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

2. 公式：

抑制羥自由基能力(U/mgHb)=×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mM)××樣本測試前稀釋倍數(shù)÷血紅蛋白含量(mgHb/ml)

3. 計(jì)算舉例：

取抗凝紅細(xì)胞0.2ml加蒸餾水0.8ml，漩渦混勻器充分混勻1分鐘制得溶血液，同時(shí)測定血紅蛋白為 41.182mgHb/ml。取0.01ml溶血液加5.99ml雙蒸水，充分混勻后取0.2ml按操作表進(jìn)行檢測， 測得對照管OD為0.837，測定管OD為 0.648，標(biāo)準(zhǔn)管OD為0.504，標(biāo)準(zhǔn)空白OD為0.016，標(biāo)準(zhǔn)濃度為8.824mmol/L，則計(jì)算結(jié)果為：

抑制羥自由基能力(U/mgHb)=×8.824××600÷41.182=248.96U/mgHb′′ ′ ′ ? = - =

（四）產(chǎn)生羥自由基能力的計(jì)算：

1. 定義：規(guī)定每毫升、每毫克或每立方厘米內(nèi)10⁶個(gè)細(xì)胞在本反應(yīng)體系中使反應(yīng)液中H₂O₂濃度增加1mmol/L為一個(gè)產(chǎn)生羥自由基能力單位。

2. 公式：

產(chǎn)生羥自由基能力(U/ml)=×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mM)××樣本測試前稀釋倍數(shù)

3. 計(jì)算舉例：

某種藥物稀釋10倍后取0.2ml檢測，結(jié)果如下：標(biāo)準(zhǔn)空白管OD為 0.009，標(biāo)準(zhǔn)管OD為 0.440， 測得對照管OD為0.217，測定管OD為 0.621。則計(jì)算如下：

產(chǎn)生羥自由基能力(U/ml)=×8.824××10=413.56U/ ml

注意事項(xiàng)：

1. 必須每一只管子單獨(dú)做，并且反應(yīng)時(shí)間一分鐘一定要準(zhǔn)確。

2. 必須嚴(yán)格按照操作表順序加試劑，不可配制混合試劑。

3. 檢測樣本溶劑或介質(zhì)可為生理鹽水，蒸餾水，醋酸，無水乙醇，但不能為磷酸緩沖液。

4. 此法檢測靈敏度較高，檢測血清（漿）和組織以外樣本時(shí)，最好先取原液及不同濃度稀釋后的樣本，例如5倍稀釋液或10倍稀釋液做預(yù)試。

附件： 羥自由基最佳取樣濃度及最佳取樣量預(yù)試驗(yàn)方法

一．樣本處理：

1. 血清（漿）：用生理鹽水將血清（漿）按1:1，1:4，1:9，1:19 等稀釋成一系列不同濃度的血清（漿），分別取不同濃度的血清（漿）0.1ml按血清（漿）的測定操作進(jìn)行測定。

2. 組織勻漿，細(xì)胞，線粒體或細(xì)胞膜等組織：分別用生理鹽水將組織勻漿等稀釋成10%，5%，2%，1%，0.5%，0.1%等一系列不同濃度的組織勻漿，分別取不同濃度的組織勻漿0.2ml按組織的測定操作進(jìn)行檢測。

二．操作步驟舉例： 

（一） 血清（漿）最佳取樣濃度及最佳取樣量預(yù)試驗(yàn)方法舉例：

1. 樣本：以正常組大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血漿測活性氧為例。

2. 樣本稀釋：用生理鹽水將血清（漿）按1:1，1:4，1:9，1:19等稀釋成一系列不同濃度的血清（漿），分別取不同濃度的血清（漿）0.2ml按血清（漿）的測定操作進(jìn)行測定。

3. 操作表：

混勻，37℃反應(yīng)1分鐘，加完試劑C開始計(jì)時(shí)一分鐘，立即加入顯色劑終止反應(yīng)，一次只能做一只管子。

混勻，室溫放置20分鐘后，1cm光徑，550nm，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

4. 預(yù)試結(jié)果：

5. 結(jié)論：

從上面的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可以看出，抑制率（抑制率= ×100%）在45%~55%之間的最佳取樣濃度為1:19。

取1:19稀釋正常組大鼠血漿0.2ml進(jìn)行羥自由基正式檢測。

三．討論

在您進(jìn)行正式檢測前，需要從每組中取2～3個(gè)樣本進(jìn)行上面的預(yù)試實(shí)驗(yàn)，確定最佳濃度和最佳取樣量。在保證抑制率（ 抑制率= ×100%）在20～50％間的同時(shí)，每組之間也應(yīng)該有所差異，如果您有疑問，則需要重新摸索最佳濃度和最佳取樣量。