二胺氧化酶活性檢測(cè)試劑盒 （微量法）

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1090

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動(dòng)物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過(guò)氧化氫，外源添加過(guò)量的辣根過(guò)氧化物酶，催化過(guò)氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成有色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度增加速率，計(jì)算DAO活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體70mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體0.25mL×1支，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，使用時(shí)加2mL水溶解，4℃可保存1個(gè)月。

試劑三：液體1mL×1支，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、96孔板/玻璃比色皿、蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

二、測(cè)定操作表：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

三、酶活性計(jì)算公式：

a. 使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、動(dòng)物組織DAO活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/mg prot）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(cpr×V樣本)÷T=30×ΔA÷cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/g 鮮重）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(W÷V提取×V樣本)÷T=30×ΔA÷W

2、血清（漿）DAO活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/L）=ΔA÷d÷ε×V反總÷V樣本÷T=30×ΔA

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO活性（U/10⁴cell）=ΔA÷d÷ε×V反總÷（500×V樣÷V提取）÷T= 0.06×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；V樣本：加入粗酶液體積，0.05mL；V提取，加入提取液體積，1mL；cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；d：光徑，0.6cm；ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺消光系數(shù)，7.5×10^-3mL/μmol/cm；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

b. 使用比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、動(dòng)物組織DAO活力的計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/mg prot）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(cpr×V樣本)÷T=18×ΔA÷cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/g 鮮重）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(W÷V提取×V樣本)÷T=18×ΔA÷W

2、血清（漿）DAO活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO（U/L）=ΔA÷d÷ε×V反總÷V樣本÷T=18×ΔA

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO 活性（U/10⁴cell）=ΔA÷d÷ε×V反總÷（500×V樣÷V提?。?/span>÷T= 0.036×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；V樣本：加入粗酶液體積，0.05mL；V提取，加入提取液體積，1mL；cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；d：光徑，1cm；ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺消光系數(shù)，7.5×10^-3mL/μmol/cm；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：

1、如果OD值小于0.01，適當(dāng)加大提取用樣本質(zhì)量；OD值大于0.8，粗酶液可適當(dāng)稀釋，或者減少提取用樣品質(zhì)量。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。