過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

產品貨號：BA1105

產品規(guī)格：50管/48樣

產品簡介：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

產品內容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體0.33mL×2瓶，4℃保存；用時每瓶加入5mL試劑一；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、 細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次）；8000g 4℃離心10min， 取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、 血清（漿）樣品：直接檢測。

二、測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至470nm，蒸餾水調零。

2、測定前將試劑一、二和三37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min。

3、樣本測定表

在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄470nm下30s時的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

三、POD 活性計算：

1、血清（漿）POD活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

計算公式：POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =7133×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

(3) 按細菌或細胞數(shù)量計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA

V反總：反應體系總體積，1.07mL；V樣：加入樣本體積，0.015mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、若一次性測定樣本較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按比例配成混合液，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min以上，測定時加入15µL樣本和1055µL混合液測定。

2、如果ΔA小于0.005，可將反應時間延長到5min。如果ΔA大于0.5，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。