琥珀酸脫氫鈉（SDH）活性檢測(cè)試劑盒（可見(jiàn)分光光度法）

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1164

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品說(shuō)明：

SDH（EC1.3.5.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。SDH是線粒體的一種標(biāo)志酶，位于線粒體內(nèi)膜上的一種膜結(jié)合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。此外，為多種原核細(xì)胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。

SDH催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過(guò)吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm處具有特征吸收峰，通過(guò)600nm吸光度的變化，測(cè)定2．6-DPIP的還原速度，代表SDH酶活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體60mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體0.6mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入到試劑三中溶解待用；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4mL雙蒸水，用不完的試劑仍4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入3.333mL雙蒸水，用不完的試劑4℃保存。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、SDH的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿充分研磨，4℃11000g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟和加樣表

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

    依次加各試劑到1mL比色皿中，在加入試劑六的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)；在600nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)1分鐘；迅速取出比

色皿并擦干，600nm下比色，記錄1分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2，得到ΔA測(cè)定，ΔA空白。

三、SDH活性的計(jì)算

用1mL比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（U/mgprot）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T

＝1555.556×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（U/g鮮重）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T

＝1571.111×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

SDH活性（U/10⁴cell）＝[（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T

＝3.142×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.98×10^-3L；            ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，21×10³L/mol/cm；  

d：比色皿光徑，1cm；                       V樣：加入樣本體積，0.03mL；

V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；      T：反應(yīng)時(shí)間，1min；

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；                W：樣品質(zhì)量，g；

500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)定過(guò)程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性失活。

2、若ΔA大于0.5，需將酶液用酶提取液稀釋?zhuān)?/span>ΔA小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。