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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 50管/24樣 |
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貨號 | BA1203-100 | 應用領域 | 化工,生物產業(yè) |
濾紙酶檢測試劑盒(微量法)
注意:正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
產品貨號:BA1203
產品規(guī)格:100管/48樣
測定意義:
纖維素酶是由微生物產生的多組分的酶系,能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖,研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。
測定原理:
濾紙酶水解濾紙產生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物,在540nm處有最大光吸收,在一定范圍內反應液顏色深淺與還原糖的量成正比,可測定計算得濾紙酶的活力。
產品內容:
試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體40mL×1瓶,4℃保存。
濾紙條:50mg×50條。
需自備的儀器和用品:
天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
酶液提取:
1. 組織:按照質量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL蒸餾水)加入蒸餾水,冰浴勻漿后于4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測。
2. 細胞:按照細胞數(shù)量(104個):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 培養(yǎng)液或其它液體:直接檢測。
測定操作:
1. 根據樣本數(shù)量取兩倍數(shù)量的濾紙條和Ep管,每支Ep管中放入一個卷狀濾紙條(注意要放入底部),作為底物。2. 對照管:取200μL滅活的酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標注為對照管。3. 測定管:取200μL酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標注為測定管。
4. 對照管和測定管同時置于50℃水浴鍋中反應30min。
5. 加入800μL試劑二,沸水浴5min,自來水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測定540nm處吸光值,分別記為A對照管和A測定管,△A=A測定管-A對照管。
酶活性計算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線:y=0.2805x-0.0255,R2=0.9991
(1)按照蛋白濃度計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
=0.891×(△A+0.0255)÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=0.891×(△A+0.0255)÷W
(3)按液體體積計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反總÷V樣÷T
=0.891×(△A+0.0255)
(4)按細胞數(shù)量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每104個細胞每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷0.2805×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量(萬個)÷V樣總)÷T
=0.891×(△A+0.0255)÷細胞數(shù)量(萬個)
V反總:反應總體積,1.5mL,V樣:反應體系中加入樣本體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,30min
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y=0.1403x-0.0255,R2=0.9991
(1)按照蛋白濃度計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
=1.782×(△A+0.0255)÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1.782×(△A+0.0255)÷W
(3)按液體體積計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫升培養(yǎng)液每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反總÷V樣÷T
=1.782×(△A+0.0255)
(4)按細胞數(shù)量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每104個細胞每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量(萬個)÷V樣總)÷T
=1.782×(△A+0.0255)÷細胞數(shù)量(萬個)
V反總:反應總體積,1.5mL,V樣:反應體系中加入樣本體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,30min
注意事項:
1. 用干凈的鑷子取出濾紙條,帶手套卷成卷放入Ep管底部。
2. 樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致,建議沸水浴十分鐘。
3. 批量樣本測定之前先做1-2個樣本的預實驗,若吸光值超過1.2,建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定,計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條,以免帶入毛狀物,影響測定結果。
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